[发明专利]检测松材线虫的LAMP引物、检测方法及LAMP检测试剂盒

权利要求书

1.用于检测松材线虫的LAMP引物组，其特征在于，选自以下4组LAMP引物组中的任意一组：

2号LAMP引物组：由一对外引物对，一对内引物对和一对环引物对组成，其中，所述外引物对由上游外部引物SEQ ID NO.7和下游外部引物SEQ ID NO.8组成，所述内引物对由上游内部引物SEQ ID NO.9和下游内部引物SEQ ID NO.10组成，所述环引物对由SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12所示的环引物组成；

3号LAMP引物组：由一对外引物对，一对内引物对和一对环引物对组成，其中，所述外引物对由上游外部引物SEQ ID NO.13和下游外部引物SEQ ID NO.14组成，所述内引物对由上游内部引物SEQ ID NO.15和下游内部引物SEQ ID NO.16组成，所述环引物对由SEQ IDNO.17和SEQ ID NO.18所示的环引物组成；

6号LAMP引物组：由一对外引物对，一对内引物对和一对环引物对组成，其中，所述外引物对由上游外部引物SEQ ID NO.31和下游外部引物SEQ ID NO.32组成，所述内引物对由上游内部引物SEQ ID NO.33和下游内部引物SEQ ID NO.34组成，所述环引物对由SEQ IDNO.35和SEQ ID NO.36所示的环引物组成；

7号LAMP引物组：由一对外引物对，一对内引物对和一对环引物对组成，其中，所述外引物对由上游外部引物SEQ ID NO.37和下游外部引物SEQ ID NO.38组成，所述内引物对由上游内部引物SEQ ID NO.39和下游内部引物SEQ ID NO.40组成，所述环引物对由SEQ IDNO.41和SEQ ID NO.42所示的环引物组成。

2.根据权利要求1所述的LAMP引物组，其特征在于，所述的LAMP引物组是6号LAMP引物组。

3.权利要求1或2所述的LAMP引物组在检测松材线虫中的应用。

4.一种检测松材线虫的LAMP检测方法，其特征在于，包括：

(1)从待检测的松树样品中提取DNA；(2)以提取的DNA为模板加入包括LAMP引物组、BstDNA聚合酶在内的组分建立LAMP反应体系，进行实时荧光PCR扩增；(3)于63℃45s处收集荧光信号，若有“S”型扩增曲线，则判断为阳性，即有核酸扩增；若无“S”型扩增曲线，则判断为阴性，即无核酸扩增。

5.根据权利要求4所述的LAMP检测方法，其特征在于，步骤(2)中所述的实时荧光PCR扩增的反应程序为63℃15s，63℃45s作为一个扩增循环。

6.根据权利要求4所述的LAMP检测方法，其特征在于，所述的松树是任何一种被松材线虫侵染的松树，包括但不限于：马尾松、白皮松、樟子松、五针松、黑松、红松、油松、乔松、赤松、琉球松、欧洲黑松、海岸松、欧洲山松、辐射松、西黄松、西部白松、中国台湾黑松、湿地松、刚松、扭叶松、北美乔松、火炬松、长叶松、北美短叶松、刺叶松或加勒比松。

7.一种检测松材线虫的LAMP试剂盒，该试剂盒包括：LAMP引物组，Bst DNA聚合酶，LAMP反应缓冲液，dNTPs和荧光染料；其特征在于，所述的LAMP引物组是权利要求1或2所述的LAMP引物组。

8.根据权利要求7所述的LAMP试剂盒，其特征在于，所述的荧光染料是SYBR GreenI。

9.权利要求8或9所述的LAMP试剂盒在检测松材线虫中的应用。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，包括：(1)从待检测的松树样品中提取待检测样品的DNA，以该DNA为模板建立LAMP反应体系；(2)将LAMP反应体系进行实时荧光PCR扩增；(3)于63℃45s处收集荧光信号，若有“S”型扩增曲线，则判断为阳性，即有核酸扩增；若无“S”型扩增曲线，则判断为阴性，即无核酸扩增。