[发明专利]一种Rg1联合hAD-MSCs治疗POI的实验方法

权利要求书

1.一种Rg1联合hAD-MSCs治疗POI的实验方法，其特征在于，具体包括以下步骤：

1)人羊膜间充质干细胞hAD-MSCs的培养：hAD-MSCs细胞培养于含10％胎牛血清FBS的RPMI 1640培养液中，并添加1％的青霉素-链霉素，在充入5％CO2的湿润的37℃恒温细胞培养箱中培养，将细胞连续传代在第3代的细胞用于后续实验；

2)流式细胞术对hAD-MSCs的鉴定：对培养第3代的hAD-MSCs细胞的表面标志物进行流式细胞术分析，以确定其干细胞特性，收获细胞并以250×g于室温离心5min，然后将细胞沉淀重悬于PBS中制备单细胞悬液，并使细胞浓度为1×105/ml，细胞分别与抗人CD-133、抗人CD-45、抗人CD-73、抗人CD-105和抗人CD-90单抗于室温避光孵育20min，然后用PBS清洗细胞2次去除一抗，细胞随后与偶联有FITC或PE的山羊抗鼠IgG二抗于4℃避光孵育30min，最后，用1％多聚甲醛溶液固定细胞，上机流式细胞仪，使用Kaluza软件进行分析，表面标志物CD11b-/CD19-/CD34-/CD45-/HLA-DP/DQ/DR-/CD44+/CD73+/CD90+/CD105+为目的细胞类型；

3)辐射诱导构建卵巢功能不全POI大鼠模型：将5-6周龄雌性SD大鼠饲养于温度受控、具有标准光/暗循环的鼠房内，大鼠自由饮水和进食，适应性饲养一周后，将其随机分为5组，每组10只大鼠：①Control组：正常对照组大鼠，仅对大鼠行腹腔注射100mg/kg氯胺酮和10mg/kg甲苯噻嗪麻醉，不进行放疗辐照；②Model组：向大鼠腹腔注射100mg/kg氯胺酮和甲苯噻嗪10mg/kg麻醉后，进行CT定位，利用精密VMAT医用直线加速器，避开心、肝、脾、肺、肾，并准确限定至盆腔放疗照射目标区域，照射距离为1m，设置单次照射剂量为4.8Gy，建立POI大鼠模型，大鼠在接受放疗照射后每周观察一次，连续观察共4周；③hAD-MSCs组：即hAD-MSCs治疗组，大鼠接受放疗照射后，将制备好的重悬于0.5ml PBS中的3×106hAD-MSCs，单次通过尾静脉注射入大鼠体内；④hAD-MSCs+Rg1组：即hAD-MSCs联合Rg1治疗组，大鼠接受放疗照射造模后，首先接受单次尾静脉注射hAD-MSCs治疗，然后连续2周，每日早上8时，将溶解于3ml无菌去离子水的，单次剂量为20mg/kg/d的Rg1通过腹腔注射大鼠，每组10只实验大鼠，其中5只用于采集卵巢和血液等组织样本，另外5只进行卵母细胞诱导，进行卵母细胞线粒体功能测定相关实验。