[发明专利]一种高灵敏度检测动物布鲁氏菌病的方法

说明书

本发明公开了一种微滴数字PCR法检测布鲁氏菌病的引物、探针及检测方法，其中引物和探针适用于微滴数字PCR法检测，并且能够准确地检测出布鲁氏菌质粒，与猪链球菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、巴氏杆菌、大肠杆菌、苍白念球菌、牛分枝杆菌样本核酸无交叉反应，特异性达100％；检测方法灵敏、准确，利于检测潜伏感染和低量感染，本发明提供的基于微滴数字PCR法高灵敏度检测布鲁氏菌病的方法，可检测到样本中1个拷贝的布鲁氏菌。

技术领域

本发明属于细菌分子生物学检测技术领域，具体涉及一种基于微滴数字PCR检测动物布鲁氏菌病的引物、探针及检测方法。

背景技术

布鲁氏菌病(Brucellosis)，简称布病，是由布鲁氏菌属细菌引起的一种人兽共患慢性传染病，可感染多种哺乳动物，包括人类和一些两栖动物，对畜牧业发展和人畜健康构成较大威胁。人主要通过与病畜接触或食用被布鲁氏菌污染的食物感染布鲁氏菌，世界动物卫生组织(OIE)将布病列为必须通报动物疫病，我国将其列的二类动物疫病。2012年，我国发布《国家中长期动物疫病防治规划(2012—2020年)》，将布鲁氏菌病列为16种优先防治动物疫病病种。

人和动物感染布鲁氏菌后，短者1d即可发病，长者在6个月至1年才发病，潜伏期一般为7～60d，平均为14～21d。布病属多系统多脏器损伤性疾病，临床表现比较复杂。以发热、乏力、多汗、食欲差、体重下降，以及肝脾及淋巴结肿大、肌肉疼痛、骨关节炎等器质性病变等为主要症状。布病流行于170多个国家和地区，主要流行于中东、拉丁美洲、亚洲、非洲和地中海盆地等牛羊养殖集中但经济技术相对落后的地区，每年约有50万新发人间病例，造成的经济损失约30亿美元。我国当前人兽共患布病感染形势仍十分严峻。动物布病专项流调结果显示，牛羊总体布病个体阳性率为3.2％，群体阳性率为25％。

随着畜牧业的发展，我国动物布病检测的需求，特别是对动物隐形感染和鉴别诊断的需求缺口越来越大。因此，加强动物布鲁氏菌检测技术研究，为疫病的控制、净化，动物健康，公共卫生安全具有重要意义。

目前对动物布病的诊断方法有如下的几种：

1)临床诊断

动物感染布病后多数为隐形感染，症状不明显。感染早期会出现结膜炎和体温升高等特征。雌性最显著症状是流产，多为死胎或者弱仔，但大多数流产后2个月可以再次受孕。雄性发生睾丸炎、附睾炎，触摸时局部发热并有热痛感，并失去配种能力。还会出现关节炎、滑液囊炎、淋巴结炎或囊肿等。

2)细菌学诊断

布鲁氏菌的分离培养是诊断布病的最基础方法，也是检测布病的“金标准”。微生物培养技术是采集病畜的血液、骨髓、组织、脑脊液等样本做细菌培养，观察菌落生长状况并进行鉴别。但由于布鲁氏菌对环境和营养要求较高，分离培养操作过程复杂，需要专业技术人员在生物安全三级以上实验室操作，分离操作过程存在较高的生物安全风险。还受动物感染阶段、样本中病原体数量及检测前抗生素使用等因素影响，常导致细菌污染，不能及时做出诊断而使病情加重，具有明显的局限性，不适合推广应用。

2)血清学诊断

布鲁氏菌血清学诊断包括：虎红平板凝集试验(RBPT)、酶联免疫吸附试验(ELISA)、全乳环状试验(MRT)、试管凝集试验(SAT)、补体结合试验(CFT)和荧光偏振试验(FPA)等。

RBPT、SAT和MRT是检测布病常用的初筛方法，其本质都是抗原抗体反应。RBPT操作简单，敏感性较高，但特异性和准确性一般，不能准确判定结果；SAT的敏感性较高，但操作复杂，耗时较长；MRT操作简单，但敏感性较差，可能出现假阳性；ELISA、CFT和FPA常用于血清学诊断布病的确诊方法，都具有敏感性高、特异性强等特点，但对成本和试验条件的要求较高。

血清学诊断技术在常规诊断方面有重要作用，但对于鉴定动物的隐形感染以及疫苗株免疫与野毒株感染的鉴别诊断方面，还存在一定的局限性。