[发明专利]一种高灵敏度检测动物布鲁氏菌病的方法

权利要求书

1.一种检测动物布鲁氏菌的基于微滴数字PCR方法扩增用引物和探针，其特征在于，所述的引物和探针包含有：

上游引物，其核酸序列为SEQ ID NO：1；

下游引物，其核酸序列为SEQ ID NO：2；

探针的其核酸序列为SEQ ID NO：3。

2.如权利要求1所述的引物和探针，其特征在于，所述的探针的5′端和3′端分别用荧光报告基团和荧光淬灭基团进行修饰。

3.如权利要求2所述的引物和探针，其特征在于，所述的荧光报告基团为FAM；荧光淬灭基团为BHQ1。

4.一种微滴数字PCR检测试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒中包含有权利要求1-3任一项所述的引物和探针。

5.一种检测动物布鲁氏菌的方法，其特征在于，所述的方法是微滴数字PCR检测方法，其中使用了权利要求1-3任一项所述的引物和探针。

6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述的方法包括如下的步骤：

1)提取待检测对象的核酸样品；

2)将微滴制备仪接通电源进行预热，放入收集反应体系的8联管，根据待检样品数，在控制电脑上选择相应孔道；

3)在反应缓冲液中加入上游引物、下游引物和探针，再加入步骤1)中得到的核酸样品，充分混合，得到水相反应体系；

4)将微液滴生成芯片装入芯片适配件，在水相溶液孔中加入步骤3)得到的水相反应体系，在油相溶液孔中加入微滴生成油，盖上微滴生成密封盖，放入微滴制备仪生成微滴；

5)制备结束后，将收集反应体系的8联管取出，进行PCR反应；

6)微滴检测仪接通电源进行预热，将装有反应体系的8联管放入微液滴检测芯片适配件中，微液滴检测芯片放入适配件，确保芯片将8联排管盖刺穿，在芯片孔位加入检测试剂，盖上微液滴检测芯片密封垫盖，放入微滴检测仪中进行样本检测。

7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述的引物和探针的终浓度分别为300nM～1μM和150nM～500nM。

8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述的引物中，上游引物和下游引物的终浓度为800nM。

9.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述的PCR反应温度为4844～6343℃。

10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述的PCR反应温度为5445℃。