[发明专利]快速分型检测HPV16型和HPV18型病毒的引物组、试剂盒及分析方法

说明书

本发明公开了一种快速分型检测HPV16型和HPV18型病毒的引物组、试剂盒及其分析方法，为选择HPV16型和HPV18型的L1区设计特异的RPA引物组，所述RPA引物组的核酸序列包括通用上游引物F和通用下游引物R；使用特异性的探针对通用引物进行区分，并对其进行不同标记，其中通用下游引物R的序列5端用FAM标记；试剂盒包括RPA扩增总反应体系和双标记的胶体金免疫层析试纸条。本发明克服了现有技术的不足，首次采用多重RPA技术对HPV病毒进行检测并对感染率最高的HPV16型和18型进行分型鉴定，整个流程操作简单，全程无需专业人员及设备，成本低廉，检测时间短，具有高灵敏度及高特异性。

技术领域

本发明涉及免疫学领域，尤其涉及一种快速分型检测HPV16型和HPV18型病毒的引物组、试剂盒及分析方法。

背景技术

开展宫颈癌筛查可以有效降低宫颈癌的发病率和死亡率。在北美、澳大利亚及欧洲等已有完善筛查制度的国家或地区，宫颈癌的发病率和死亡率均明显下降。而在发展中国家，子宫颈癌的发病率和死亡率却没有明显改善。

我国是世界上最大的发展中国家，开展大规模宫颈癌筛查对提高人类质量具有重要的推动作用。大多数的宫颈癌是由人乳头瘤病毒(HPV)引起。根据致病性大小HPV可以分为高危型和低危型。约99.7％的宫颈癌是由高危型人乳头瘤病毒持续或反复感染所致。因此HPV核酸的检测在宫颈癌的早期筛查中扮演着重要的角色，很大程度上提升了宫颈癌和癌前病变的检出率。其中HPV感染率最高的为HPV16、18型，约占宫颈癌的70％，另外一项持续10年的统计不同高危型别HPV感染后≥CIN2病变累积发病率的研究，证实基线筛查时HPV16或18阳性，10年后高度病变的累积发病率明显高于其它型别感染或HPV阴性者，因此HPV16/18分型包含在HPV初筛中对风险分层的管理意义重大。

常见的HPV检测方法有DNA杂交捕获法-HC-II，采用分子杂交和化学发光信号放大的原理，无需基因扩增，属于线性级数放大，可检测13种HPV高危型别但不分型，但操作繁琐，耗时长，易产生交叉污染，成本费用较高；PCR荧光技术，采用升降温方式，收集荧光，可单管检测多种型别。虽然操作相对简单，但整个扩增也需要1-2小时完成，时间长，且信号的收集需要依靠昂贵的PCR仪，对仪器的操作也需要经过培训的专业人员，无法实现即时检测及床旁诊断。随着DNA扩增技术发展，也出现了恒温扩增方式，虽然在扩增时间上有所突破，但大部分仍需要荧光分析仪对结果进行收集分析，且不能对HPV进行准确分型，灵敏度和特异性也均不能满足临床需求。如基于恒温扩增技术的有专利CN110387436A，利用恒温(60℃)扩增技术扩增模板，通过机器收集荧光信号检测HPV 15种高危型别，但耗时长，需要1.5小时；专利CN110396557A，基于CRISPR_Cas12a及RPA技术富集模板，也是靠收集荧光信号判断阴阳性；专利CN111073997A，常温扩增后，通过免疫层析试纸条对结果进行判断，但不能将HPV16和18进行分型。

因此亟待一种能够即时、简便、准确的核酸检测方法对HPV病毒进行检测和分型。

发明内容

为了解决现有技术的问题，一方面，本发明提供了一种快速分型检测HPV16型和HPV18型病毒的引物组，为选择HPV16型和HPV18型的L1区设计特异的RPA引物组，所述RPA引物组的核酸序列包括：

通用上游引物F:5’-GAATATGATTTACAGTTTATTTTTCAGCTGTG-3’；

通用下游引物R:5’-FAM-ATTTAAAGGAAAAGTTTTCTGTAGACCTAGATCA-3’；

使用特异性的探针对通用引物进行区分，并对其进行不同标记，其中通用下游引物R的序列5端用FAM标记，HPV16型探针序列5端标记生物素，3端用C3 spacer进行封闭，中间距离3端15个碱基处使用四氢呋喃进行处理；HPV18型探针序列5端标记地高辛，3端用C3spacer进行封闭，中间距离3端15个碱基处使用四氢呋喃进行处理，具体的引物组序列及其标记如下：