[发明专利]一种玉米赤霉醇免疫亲和柱及其制备方法和用途

说明书

本发明公开了一种玉米赤霉醇免疫亲和柱，包括偶联有玉米赤霉醇单克隆抗体的固相载体、装载其的塑料管及保存液，所述玉米赤霉醇单克隆抗体是以玉米赤霉醇半抗原‑载体蛋白偶联物作为免疫原制备获得，所述玉米赤霉醇半抗原是以玉米赤霉酮为起始原料，在L‑羟脯氨酸盐的催化下，与三甲基氰硅烷反应得到氰醇化合物，再对氰基进行水解反应得到的。本发明提供的玉米赤霉醇免疫亲和柱结构简单、使用方便、特异性强，可快速提取动物源性食品中的玉米赤霉醇残留。

技术领域

本发明属于免疫亲和层析技术领域，具体而言，本发明涉及一种玉米赤霉醇免疫亲和柱及其制备方法和用途。

背景技术

玉米赤霉醇又名“右环十四酮酚”，商品名为“畜大壮”，是一种效果理想的皮埋增重剂，能提高畜禽饲料的转化率和酮体瘦肉率。但研究表明，玉米赤霉醇对哺乳动物具有一定的危害性，特别是生殖方面危害。虽然玉米赤霉醇在体内大部分会被代谢掉，但仍有一部分会残留在埋置部位，而且通过食物链食用含有玉米赤霉醇残留的动物源性食品后，导致消费者促性腺激素水平的降低、内分泌失调、生长发育障碍以及影响人体第二性征发育等不良影响，还具有潜在的致癌、致畸、致突变等毒性。1998年，欧盟禁止将玉米赤霉醇等激素类药物应用于畜禽养殖；2002年，我国农业部公告第235号明确规定玉米赤霉醇禁止用于所有动物，所有动物食品中不得检出。由于玉米赤霉醇作为畜禽增重剂效果好、经济效益高，仍被非法使用。

目前对动物源食品中玉米赤霉醇残留的主要检测方法有酶联免疫吸附法、胶体金免疫层析法、气相色谱-质谱联用法(GC-MS)、高效液相色谱法(HPLC)和超高效液相色谱法(UPLC)及其联合各种检测器如紫外(UV)、荧光(FL)、质谱(MS)等。进行痕量检测时要尽可能地降低背景干扰，因此对样品前处理的要求相对较高。常见的前处理方法有液液萃取法(LLE)、固相萃取法(SPE)等。但LLE需要使用大量的有机溶剂，操作繁琐，费时费力；SPE因其具有有机溶剂使用量小、吸附容量大、分离快速等特点，已成为最常用的萃取手段之一。目前常用于测定玉米赤霉醇的SPE柱有混合型阴离子交换柱(MAX柱)和亲水亲脂平衡柱(HLB柱)等，但因其不能选择性地吸附目标分子，在痕量药物测定过程中可能会引入干扰物。因此，有必要建立一种操作快捷，且具有很高的特异性和灵敏度的前处理方法。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明提供了一种玉米赤霉醇免疫亲和柱及其制备方法和用途。

为了实现上述目的，本发明采用的技术方案是：

提供一种玉米赤霉醇免疫亲和柱，所述免疫亲和柱包括偶联有玉米赤霉醇单克隆抗体的固相载体、装载其的塑料管及保存液，所述玉米赤霉醇单克隆抗体是以玉米赤霉醇半抗原-载体蛋白偶联物作为免疫原制备获得；所述玉米赤霉醇半抗原是以玉米赤霉酮为起始原料，在L-羟脯氨酸盐的催化下，与三甲基氰硅烷反应得到氰醇化合物，再对氰基进行水解反应得到的，其分子结构式为：

按上述方案，所述固相载体为溴化氰活化琼脂糖凝胶4B。

按上述方案，所述载体蛋白为牛血清白蛋白。

提供所述玉米赤霉醇免疫亲和柱的制备方法，该方法包括以下步骤：

1)固相载体活化：将溴化氰活化琼脂糖凝胶4B用1mmol/L HCl溶液浸泡30min，3000～8000r/min离心2～10min分离固相载体，再用0.1mol/L pH 9.0的CB缓冲液洗涤固相载体3～5次，5000r/min离心10min分离固相载体；

2)抗体偶联：向步骤1)活化的固相载体中加入玉米赤霉醇单克隆抗体，再加入0.1mol/L pH 9.0的CB缓冲液，37℃条件下150r/min震荡反应1h；反应结束后，离心分离偶联物，用0.1mol/L pH 8.3的NaHCO₃缓冲液洗涤偶联物3～5次；