[发明专利]一种制备飞蝗Lmzen纯合突变体的方法、RNP复合物及应用

说明书

本发明属于飞蝗生物技术和基因编辑技术领域，具体涉及一种制备飞蝗Lmzen纯合突变体的方法、RNP复合物及应用，一种制备飞蝗Lmzen纯合突变体的方法，其包括以下步骤：1)构建Lmzen基因敲除RNP复合物，其包括从5’端到3’端的以下可操作性连接的元件：T7启动子，Lmzen基因靶点和tracRNA‑crRNA所转录而成的RNA(sgRNA)；Cas9蛋白；ddHsubgt;2/subgt;O；2)将步骤1)所述的Lmzen基因敲除RNP复合物共转新鲜飞蝗卵，孵化，得Gsubgt;0/subgt;代，将Gsubgt;0/subgt;代与野生型杂交得Gsubgt;1/subgt;代；3)将步骤2)所述Gsubgt;1/subgt;代自交，获得的Gsubgt;2/subgt;代，即为飞蝗Lmzen纯合突变体。本发明利用CRISPR/Cas9技术敲除飞蝗zen基因，提供了稳定有效的Lmzen纯合突变体品系。首次敲除飞蝗zen基因，成功实现了纯合突变体的构建，其后代具有大量死亡表型。

技术领域

本发明属于飞蝗生物技术和基因编辑技术领域，具体涉及一种制备飞蝗 Lmzen纯合突变体的方法、RNP复合物及应用。

背景技术

飞蝗(Locusta migratoria)是世界农业生产中危害最严重的害虫之一，中国是蝗灾的历史多发地，给国家和人民造成了巨大的损失。目前我国的蝗虫防治体系主要包括以下四种方式：(1)化学防治：喷洒农药；(2)生物防治：牧鸡、牧鸭治蝗；(3)生态控制；(4)微生物防治：绿僵菌、病毒等。从分子层面研究蝗虫的生物防治，对我国害虫生物防治具有重要意义。

zerknüllt(zen)是有翅昆虫中起源的Hox3同源基因，它的起源、表达位置和功能分化均与昆虫胚外膜的起源和进化对应。zen在部分完全变态类鞘翅目、双翅目和渐变态类半翅目中参与浆膜形成、形态变化和浆膜表皮形成，飞蝗是低等渐变态类直翅目昆虫，其卵具有完整的浆膜和浆膜表皮；飞蝗仅有1个 Lmzen，分别参与浆膜细胞多核化、浆膜表皮形成和表皮几丁质合成酶基因表达等多个过程。但zen调控机制研究的匮乏和低等昆虫中功能研究的缺失，使得目前难以阐明zen与胚外膜形成和起源的关系，因而需要在新的模式昆虫中解析zen调控浆膜和浆膜表皮形成的分子机制。

CRISPR/Cas9是进行特定基因功能研究的一种高效工具，它可以精确定位并切断DNA上的某个基因位点，关闭基因片段，也可引入新的基因片段，近年来该技术已广泛应用于动物、植物、微生物。在飞蝗中，已有课题组利用 CRISPR/Cas9系统进行飞蝗的基因功能研究，但利用该技术研究敲除zen基因、获得纯合突变体还未见报道。

发明内容

本发明针对上述问题提供了一种制备飞蝗Lmzen纯合突变体的方法、RNP 复合物及应用。

为达到上述目的，本发明提供了一种制备飞蝗Lmzen纯合突变体的方法，其包括以下步骤：

1)构建Lmzen基因敲除RNP复合物，其包括从5’端到3’端的以下可操作性连接的元件：T7启动子，Lmzen基因靶点和tracRNA-crRNA所转录而成的 RNA(sgRNA)；Cas9蛋白；ddH₂O；

2)将步骤1)所述的Lmzen基因敲除RNP复合物共转新鲜飞蝗卵，孵化，得G₀代，将G₀代与野生型杂交得G₁代；

3)将步骤2)所述G₁代自交，获得的G₂代，即为飞蝗Lmzen纯合突变体。

优选的，所述的LmZen基因靶点的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

优选的，所述的共转是将所述RNP复合物显微注射新鲜飞蝗卵。