[发明专利]猫胱抑素C荧光定量检测试剂及其制备方法

说明书

本发明提供猫胱抑素C荧光定量检测试剂及其制备方法，涉及生物检测领域。该猫胱抑素C荧光定量检测试剂，包括以下原料：处理液、玻璃纤维膜、MES缓冲液、微球、EDC‑HCl、NHS、封闭剂、标记稀释液。该制备方法包括以下步骤：S1、(1)用10mM的PBS配以下溶液：3％BSA、3％蔗糖、1％PVP‑K30、1％酪蛋白、1％PEG20000、0.1％Triton X‑100、0.02％NaN3；(2)室温下，用所述处理液浸泡玻璃纤维膜12h；S2、用0.25ml、20mmol/L的MES缓冲液稀释0.25mL、1μmol/L微球浓度至0.5μmol/L；S3、向所述MES缓冲液内加入5ul且浓度为20mg/ml的EDC‑HCl和5ul且浓度为20mg/ml的NHS；S4、微球活化后，立即加入0.1mg待标记抗体；S5、加入25μl封闭剂，用2ml标记稀释液重新悬浮、分散；S6、喷制结合垫。通过提高试剂测试的灵敏度和延长试剂有效期，易于工业化生产。

技术领域

本发明涉及生物检测领域，具体为猫胱抑素C荧光定量检测试剂及其制备方法。

背景技术

肾脏病早期诊断一直是人们关注的问题，评价犬猫肾功能的金标准是肾小球滤过率(GFR)，一般由菊粉或碘己醇试验测量，可是这种方法对于临床来说技术要求高、操作难度大，因此，在兽医临床中常通过测定血清尿素氮(BUN)和血清肌酐(Crea)来评价肾功能水平，事实上血清尿素氮(BUN)和血清肌酐(Crea)的浓度会受很多其他因素影响，如摄食状态、机体机能、体重、肌肉量等。此外，在肾小球滤过率(GRF)降低75％时，血清肌酐(Crea)浓度才会明显上升，因此，人们在寻找更敏感的肾功能标志物的路上，从未停歇。胱抑素C是一种半胱氨酸蛋白酶抑制剂，其产生速率稳定，且只通过肾脏代谢，是一种敏感性好、特异性高的肾小球滤过率内源性标志物，动物常规体检时进行胱抑素C筛查，对发现宠物早期肾功能异常有指导意义。

对于宠物胱抑素C筛查，可以及早发现早期肾损伤，通过对早期肾损伤进行干预和治疗，可以有效地延长宠物的寿命，提高宠物生活质量，但现有技术中的猫胱抑素C一般采用试剂盒配合检测仪器使用，配备成本高，使用不够方便。

发明内容

(一)解决的技术问题

针对现有技术的不足，本发明提供了猫胱抑素C荧光定量检测试剂及其制备方法，解决了采用试剂盒配合检测仪器使用成本高且使用不够方便的问题。

(二)技术方案

为实现以上目的，本发明通过以下技术方案予以实现：猫胱抑素C荧光定量检测试剂，包括以下原料：处理液、玻璃纤维膜、MES缓冲液、微球、EDC-HCl、NHS、封闭剂、标记稀释液。

优选的，所述的猫胱抑素C荧光定量检测试剂的制备方法，以0.1mg抗体标记量计算，包括以下步骤：

S1、结合垫预处理

(1)用10mM的PBS配以下溶液：3％BSA、3％蔗糖、1％PVP-K30、1％酪蛋白、1％PEG20000、0.1％Triton X-100、0.02％NaN3，制得处理液；

(2)室温下，用所述处理液浸泡玻璃纤维膜12h，温度为42℃条件下鼓风干燥机中干燥16h，得到结合垫；

S2、微球缓冲体系调整

用0.25ml、20mmol/L的MES缓冲液稀释0.25mL、1μmol/L微球浓度至0.5μmol/L，最终缓冲体系为10mmol/L的MES缓冲液，其中MES缓冲液为pH6.0；

S3、微球活化

向所述MES缓冲液内加入5ul且浓度为20mg/ml的EDC-HCl和5ul且浓度为20mg/ml的NHS，快速混匀后37℃条件下反应15min，10000g离心20min，弃上清，用10mmol/L、pH6.0的MES缓冲液重新悬浮至体积为0.25mL，混匀；