[发明专利]高通量检测棉花GhFAD2-1基因高油酸突变位点的KASP分子标记

说明书

本发明公开了一种高通量检测棉花GhFAD2‑1基因高油酸突变位点的KASP分子标记，其中与GhFAD2‑1A核苷酸突变位点连锁的分子标记为KASP‑A429，与GhFAD2‑1D核苷酸突变位点连锁的为KASP‑D429，本发明还设计了GhFAD2‑1A基因和GhFAD2‑1D基因的特异性扩增引物及通用引物对待测棉花样品进行PCR扩增，然后应用LGC高通量标记检测平台检测棉花GhFAD2‑1A基因和GhFAD2‑1D基因等位变异，如检测棉花样品中GhFAD2‑1A和GhFAD2‑1D同时发生纯和突变，则为高油酸棉花样品。该方法将使得棉花高油酸育种过程中的大群体筛选变得更为高效、经济、简单、准确。

技术领域

本发明涉及一种高通量检测棉花GhFAD2-1基因高油酸突变位点的KASP分子标记，属于生物技术领域。

背景技术

棉花是重要的纤维作物和油料作物。纤维仅占棉花经济产量的40％左右，而棉籽约占60％。棉籽中油分含量约为25～39％，是我国第五大食用油来源，仅次于大豆、花生、油菜和向日葵。棉籽油含有较高的不饱和脂肪酸，易被人体吸收，是理想的色拉油、起酥油、人造黄油以及特种油脂的原料。

植物油中脂肪酸的组成和含量决定了食用油的营养价值和油脂稳定性。棉籽油中的脂肪酸主要由棕榈酸、油酸和亚油酸组成，其中亚油酸含量较高，约占46.7-58.2％，而油酸含量较低，约占14.7-21.7％。亚油酸(C18:2)为多不饱和脂肪酸，其性质不稳定，热稳定性及抗氧化性能都比较差，不耐储存，高温烹调时易变质；而油酸(C18:1)作为单不饱和脂肪酸，具有较高的稳定性且在烹调过程中不易产生反式脂肪酸，受到广大消费者青睐，被营养学界誉为“安全脂肪酸”。高油酸(70％以上)食用油及其制品凭借其耐氧化、抗血栓、抗高血压和降低血脂浓度的特性，成为人们关注的热点。因此，提高棉籽的油酸含量成为棉籽油品质改良的重要目标。

FAD2基因是控制植物籽粒油酸、亚油酸含量的关键基因，其编码的Δ^12-脂肪酸脱饱和酶催化油酸(C18:1)进一步脱饱和形成亚油酸(C18:2)。陆地棉为异源四倍体(2n＝4X＝52，基因组AADD)，其基因组中含有8个FAD2同源基因，其中GhFAD2-1A/D主要在种子中表达，是催化油酸形成亚油酸的关键基因(徐孝兰等，2019；Chen et al.,2021)。GhFAD2-1A和GhFAD2-1D是位于不同亚基因组上的同源基因，两个基因对油酸、亚油酸含量均有贡献，这两个基因的转录同时受到抑制或酶活降低，棉籽会表现出高油酸性状。目前，仅在海岛棉中发现3份FAD2-1D单基因自然突变的种质材料，油酸含量提高至42％(Shockey et al.,2017)。陆地棉中尚未发现自然突变或人工诱变的高油酸突变体。2002年，Liu等利用RNAi技术抑制棉花FAD2基因的表达，创制出油酸含量高达77％的转基因棉花新材料。

2021年，我们实验室以棉花GhFAD2-1A/D基因为靶标，在其Fatty aciddesaturase结构域设计了1个靶点，利用pRGEB32-GhU6.9-NPT II载体构建了GhFAD2-1A/D基因的CRISPR/Cas9基因编辑载体，通过农杆菌转化棉花品系Jin668，在T1代中检测到了4个非转基因(无载体筛选标记基因)高油酸材料(m1-2、m1-3、m20-2和m27-3)，将棉籽的油酸含量从14％提高到78％，亚油酸含量从59％降低到7％(Chen et al.,2021)。经检测，m1-2的GhFAD2-1A基因(Ghir_A13G022660.1,HAU assembly)编码区429nt处插入1个T碱基，产生移码突变；GhFAD2-1D基因(Ghir_D13G023320.1,HAU assembly)编码区429nt处插入1个A碱基，也产生了移码突变。我们以m1-2为父本，分别与多个优质、高产、抗病棉花品种杂交，期望将高油酸性状转入当前主栽棉花品种中。但是利用Sanger测序方法检测杂交后代，检测效率低，检测周期长，检测成本较高，棉花高油酸育种和生产中亟需高通量检测方法。

发明内容