[发明专利]利用斑马鱼评价婴童化妆品眼刺激的方法

说明书

本发明提供了利用斑马鱼评价婴童化妆品眼刺激的方法，包括如下步骤：将发育至3天的斑马鱼胚胎暴露于含有婴童化妆品的胚胎培养液中，采用半静态培养法，在特定温度、周期性明暗环境下培养，待斑马鱼胚胎发育至6天时，对斑马鱼幼鱼的眼刺激、对光刺激的反应能力以及眼部发育相关基因的变异情况进行评价。本发明中所用的模式生物斑马鱼，具有繁殖周期短，使用药物量少、遗传水平与人类相似、个体小、胚胎透明、便于显微操作，并且斑马鱼的视觉系统与包括人类在内的其他脊椎动物非常相似的优势，斑马鱼眼睛可作为较好的视觉模型。同时，本发明选用刚繁殖发育的斑马鱼胚胎为模型，对于婴幼化妆品的评价更具有代表性。

技术领域

本发明属于毒性评价技术领域，具体涉及一种利用斑马鱼评价婴童化妆品眼刺激的方法。

背景技术

婴幼儿对于婴童化妆品的使用时必不可少的，然而在使用过程中必须考虑该类产品的安全性，尤其是沐浴、洗发类的产品由于接触眼睛，对婴童类化妆品的眼刺激评价是安全性评价的重要项目。长期以来的眼刺激评价方法为兔眼Draize试验，然而随着“3R”原则的实施，Draize试验在伦理上及科学上均受到质疑，对动物造成极大的痛苦，且试验数据存在主观性，已经不被认可。目前已有多种体外替代方法得到了欧洲化学品局、美国国家环境保护及经济合作与发展组织(OECD)的认可，其中有5种替代试验得到了OECD的认可，分别是牛角膜不透明度和渗透性试验，离体鸡眼试验、短时暴露试验、重组人角膜上皮模型试验试验以及荧光素渗漏试验。

牛角膜不透明度和渗透性试验属于离体器官试验，利用新鲜分离的牛角膜，将受试物直接加到角膜上皮的表面，通过定量检测角膜浑浊度及渗透性改变，评价待测样品的眼刺激程度；离体鸡眼试验属于离体器官试验，利用短期体外培养的鸡眼球，将受试物暴露于角膜表面。通过定量检测角膜厚度、角膜浑浊度、荧光素滞留情况及肉眼观察形态学的改变来评价角膜上皮的损伤程度，还能够通过鸡眼球的组织病理学结果来评价角膜损伤的深度并预测损伤的可逆性；短时暴露试验利用单层兔眼角膜细胞，将受试物溶解或混匀在0.9％生理盐水中，暴露于受试物5min后，用MTT法测定细胞存活率从而对受试物进行识别；重组人角膜上皮模型试验试验是将来源于正常人的表皮角质细胞、人永生化角膜上皮细胞及原代人角膜上皮细胞培养成多层高度分化的鳞状上皮组织，形成与人角膜十分相似的3D模型。将一定剂量的受试物与模型的表面充分接触，并在暴露后和暴露后的潜伏期用MTT法测量细胞存活率；荧光素渗漏试验属于基于细胞功能测定的试验。利用单层的犬肾小管上皮细胞暴露于受试物1min后，导致细胞单层上皮荧光素钠渗透性的增加情况来判断受试物引起的眼毒性强弱。

然而上述现有的评价方法的评价指标评判的主观性较强，依赖于实验者的经验，导致试验评分主观性强，实验结果具有不确定性；同时动物实验方法对动物伤害大，不符合动物保护和福利的要求；存在实验周期长，实验复杂等问题。因此急需一种能够快速简单评价婴童化妆品眼刺激性的方法的方法。

发明内容

本发明为解决上述技术问题进行，提供了一种新的利用斑马鱼评价婴童化妆品眼刺激的方法，实现婴童化妆品对眼睛刺激的直观评价。

本发明选用野生型AB品系斑马鱼为模型。由于其具有繁殖周期短，使用药物量少、遗传水平与人类相似、个体小、胚胎透明、便于显微操作，并且斑马鱼的视觉系统与包括人类在内的其他脊椎动物非常相似的优势，因此斑马鱼眼睛可作为较好的视觉模型。通过斑马鱼暴露于待测样品后，以眼睛形态变化和行为轨迹为评价指标，并结合检测眼部发育相关基因转录水平，能够快速准确评价待测样品是否具有眼刺激性。

为了实现上述目的，本发明提供的利用斑马鱼评价婴童化妆品眼刺激的方法包括如下步骤：将发育至3天的斑马鱼胚胎暴露于含有婴童化妆品的胚胎培养液中，采用半静态培养法，在特定温度、周期性明暗环境下培养，待斑马鱼胚胎发育至6天时，对斑马鱼幼鱼的眼刺激、对光刺激的反应能力以及眼部发育相关基因的变异情况进行评价。

优选的，斑马鱼胚胎为野生斑马鱼AB品系胚胎。