[发明专利]不同热加工方式牛奶的脂质组生物标志物及其筛选方法和应用

权利要求书

1.如下的脂质组生物标志物在区分生牛奶、超高温灭菌奶、巴氏杀菌奶中的至少两种，或在区分生牛奶、超高温灭菌奶、延长货架期奶中的至少两种中的应用：

2.如下的脂质组生物标志物在区分巴氏杀菌奶与延长货架期奶区中的应用：

3.一种不同热加工方式牛奶的脂质组生物标志物的筛选方法，其特征在于，所述不同热加工方式牛奶包括生牛奶、巴氏杀菌奶、延长货架期奶和超高温灭菌奶；

所述筛选方法包括：

获取至少两种所述不同热加工方式牛奶的脂质样品的质谱图；

对所述质谱图进行处理，得到脂质定性结果；

对所述脂质定性结果进行脂质定量，并根据定量结果建立分析模型；

利用所述分析模型确定所述不同热加工方式牛奶的差异性脂质作为脂质组生物标志物；

用于将生牛奶、超高温灭菌奶、巴氏杀菌奶中的至少两种，或将生牛奶、超高温灭菌奶、延长货架期奶中的至少两种区分的脂质组生物标志物包括如下表中的脂质：

用于将巴氏杀菌奶与延长货架期奶区分的脂质组生物标志物包括如下表中的脂质：

，

所述获取所述不同热加工方式牛奶的脂质样品的质谱图的步骤，包括：将上述各个牛奶样品用水稀释后加入萃取液、神经酰胺内标和混合内标，得到混合物；将混合物进行离心处理，然后吸取上层液体至另一离心管中，上层液体含有脂质，之后，用甲基叔丁基醚对余下部分进行两次重复提取，最后，合并三次提取液并在温和氮气下吹干；提取的脂质用复溶液复溶，用于液相色谱-质谱分析；所述萃取液包括甲基叔丁基醚、甲醇中的一种或几种；所述复溶液包括二氯甲烷、甲醇中的一种或几种；

采用液相色谱-质谱分析不同热加工方式的牛奶脂质样品；

所述液相色谱-质谱分析条件包括：色谱柱为Phenomen Kinetex C18 column，所述色谱柱的规格为2.1 × 100 mm，所述色谱柱的粒径为1.7 μm；流速为0.3 mL/min，正离子模式进样量为2μL，负离子模式进样量为6μL，柱温55℃；流动相A和流动相B，洗脱程序为梯度洗脱；

所述流动相A包括乙腈水溶液和乙酸铵，所述乙腈水溶液的体积分数为40%~60%，所述乙酸铵的浓度为5mmol/L ~20mmol/L；

所述流动相B包括异丙醇、乙腈和乙酸铵；按照体积比计，所述异丙醇：所述乙腈为10:1~5:1；所述乙酸铵的浓度为5mmol/L ~20mmol/L；

所述梯度洗脱包括：

采用高分辨质谱，质谱的条件为：离子源：电喷雾离子源；数据采集范围m/z为200~2000Da；喷雾电压为：正离子模式下4500~6000 V，负离子模式下-4000~-5000 V；气帘气压力为20~45 psi；喷雾气压力为30~80 psi；加热辅助气压力为30~80 psi；离子源温度为450~600℃；去簇电压为60~120 V；碰撞能为45±25 eV；

所述对所述脂质定性结果进行脂质定量的步骤，包括：

根据所述脂质定性结果对每一种脂质的峰面积进行积分，根据相应的脂质内标峰面积对各类脂质进行定量；

所述根据定量结果建立区分模型的步骤，包括：

剔除缺失值大于50%的脂质种类，缺失值小于等于50%的脂质用该脂质在所有阳性样品中最小值的1/5填充缺失值，对数据进行归一化处理，得到预处理数据；

对所述预处理数据进行数据分析，构建可视化图表；

所述分析模型包括稀疏偏最小二乘判别分析、正交偏最小二乘判别分析、T-检验和差异倍数分析；

所述利用所述分析模型确定所述不同热加工方式牛奶的差异性脂质作为脂质组生物标志物的步骤，包括：

利用所述稀疏偏最小二乘判别分析筛选将生奶、超高温灭菌奶与巴氏杀菌奶、延长货架奶区分的差异性脂质，选择3个主成分，并分别筛选对三个主成分变量重要性最大的10种脂质；和/或

利用所述正交偏最小二乘判别分析结合所述差异倍数分析与所述T-检验筛选区分巴氏杀菌奶与延长货架期奶的差异性脂质，筛选条件包括：变量重要性＞1.7，变化倍数＞2或＜0.5，P值＜0.01且假发现率＜0.05。

4.根据权利要求3所述的不同热加工方式牛奶的脂质组生物标志物的筛选方法，其特征在于，

所述对所述质谱图进行处理，得到脂质定性结果的步骤，包括：

采用脂质组学定性软件对所述质谱图进行处理，定性条件包括：

质量数范围：200~2000Da；峰强度大于100cps；MS1精准质量偏差为0.01 Da，MS2精准质量偏差为0.025 Da；最大电荷数为2；平滑方式为线性加权移动平均，平滑级别为3；选择得分大于80的脂质；设置峰对齐保留时间偏差为0.2 分钟，MS1质量偏差，0.015 Da；并根据空白信息删除特征，手动确认注释和峰值提取结果。