[发明专利]一种双重修饰的工程化细菌及其应用

说明书

本发明属于生物医药领域，涉及一种双重修饰的工程化细菌及其应用，具体地，该工程化细是外部偶联免疫检查点抑制剂、内部编码酪氨酸酶基因的工程化细菌，包含该双重修饰的工程化细菌的的药物组合物及其应用。其中，该工程化细菌优选大肠杆菌。利用该工程化细菌，获得在空间和时间上可控的黑色素表达、分布，而且黑色素与抑制剂分布相似，两者结合增强双免疫激活作用，协同重编程肿瘤免疫微环境。该工程化细菌，单独地或组合常规肿瘤治疗方式或药物，能够显著抑制肿瘤生长和延长生存期。包含该细菌的药物组合物的药物组合物或其应用不仅克服了棘手的肿瘤内屏障，且渗透性好，能够均匀和持久地将抗肿瘤药物分散到整个肿瘤。

技术领域

本发明属于生物医药领域，涉及一种编码酪氨酸酶基因的工程化细菌，具体地，涉及一种双重修饰的工程化细菌及其应用，该细菌是外部偶联免疫检查点抑制剂、内部编码酪氨酸酶基因的工程化细菌，包含该细菌的药物组合物及其应用。

背景技术

在肿瘤治疗方面，能够在整个肿瘤中均匀和持久地分布抗肿瘤药物的方法对于最大化其治疗效果具有重要意义，但已被证明是极具挑战性的。目前，抗肿瘤药物在肿瘤组织内积累有限，渗透能力差，往往影响其疗效。各种温和的负载型纳米颗粒已经被开发出来，其用于通过高渗透长滞留EPR效应在肿瘤部位浓缩药物。尽管提高了药物浓度，但总体的富集程度还不能尽如人意。更糟糕的是，由于多种生物屏障的存在，大多数聚集的纳米颗粒被滞留在肿瘤血管周围，导致对远端肿瘤细胞仅暴露极低的药物浓度。另一方面，局部给药，例如肿瘤内注射包埋药物的水凝胶，已被开发用于药物的缓释。这尽管能够增加局部暴露，但是释放的药物同样受到肿瘤内屏障(包括致密的细胞外基质和肿瘤间质压力)的限制扩散，导致仅在注射点周围高浓度。此外，由于存在不可避免且棘手的生物屏障，其他形式的药物，如抗体-药物偶联物、聚合物前药物和配体-药物偶联物，在实体肿瘤内的渗透性也很差。因此，为了最大限度地提高其治疗效果，能够均匀和持久地将抗肿瘤药物分散到整个肿瘤的方法一直是研究人员期望实现的，但已被证明是困难的。

考虑到上述缺陷或不足，本发明申请的发明人及其团队研究并在此公开一种经双重修饰的工程化细菌及其在实体肿瘤治疗中的应用，其中该工程化细菌，通过基因工程和高分子化学手段，在细菌内外同时修饰细菌，使其靶向肿瘤部位，且在时空上可控地分布有效组分黑色素和免疫检查点抑制剂，以重新编程免疫抑制微环境，从而优化抗肿瘤治疗方式及效果。

发明内容

第一方面，本发明申请提供一种双重修饰的工程化细菌，该工程化细菌在外部偶联免疫检查点抑制剂，在内部编码酪氨酸酶基因。

进一步地，该工程化细菌包括编码酪氨酸酶基因，具体地，将包括编码酪氨酸酶基因的质粒DNA转化到细菌中，获得一种工程化细菌，然后，将在碱性溶液中将免疫检查点抑制剂锚定到细菌表面。

进一步地，该细菌是大肠杆菌和减毒沙门氏菌，优选地，Nissle1917和VNP20009，更有选地，BL21(DE3)。

进一步地，该免疫检查点抑制剂包括选自CTLA-4抑制剂、PD-1抑制剂、PD-L1抑制剂和TIGIT抑制剂中的一种或多种。该免疫检查点抑制剂包括选自抗CTLA-4抗体、抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体和抗TIGIT抗体中的一种或多种。优选地，抗PD-1抗体。

第二方面，本发明提供了一种制备上述任一双重修饰的工程化细菌的方法，包括：

步骤1：将编码酪氨酸酶基因的质粒DNA转化到细菌中，获得一种能够表达黑色素的菌株；和

步骤2：通过多巴胺在有氧碱性溶液中氧化和自聚合的方式将免疫检查点抑制剂共沉积到表达黑色素的菌株的表面。