[发明专利]一种用于新冠病毒D614G突变的检测方法及试剂盒

权利要求书

1.一种用于新冠病毒D614G突变的检测试剂盒，其特征在于：包括LbaCas12a、针对非突变株D614的特异性614-crRNA-W序列、针对突变株G614的特异性614-crRNA-M序列、针对新冠病毒和突变株特征序列的RT-RAA引物或RT-PCR引物、报告单链DNA分子；

所述的D614的特异性614-crRNA-W序列如SEQ ID NO：1所示，G614的特异性614-crRNA-M序列如SEQ ID NO：2所示；

所述的针对新冠病毒和突变株特征序列的RT-RAA引物为如SEQ ID NO：3～4所示的614-RT-RAA-primer F/R引物组；所述的614-RT-RAA-primer F/R引物组用于扩增含有与614-crRNA-W和/或614-crRNA-M互补的核酸片段；

所述的针对新冠病毒和突变株特征序列的RT-PCR引物为如SEQ ID NO：5～6所示的614-RT-PCR-primer F/R引物组；所述的614-RT-PCR-primerF/R引物用于扩增含有于614-crRNA-W和/或614-crRNA-M互补的核酸片段。

2.根据权利要求1所述的用于新冠病毒D614G突变的检测试剂盒，其特征在于：

所述的报告单链DNA分子为SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：8。

3.一种用于新冠病毒D614G突变的检测方法，其特征在于：该方法用于非诊断或治疗目的，包括如下步骤：

(1)针对新冠病毒野生株以及突变株的基因组序列，设计非突变D614和突变G614位点特异性的614-crRNA-W和614-crRNA-M序列，设计的crRNA序列如序列表中SEQ ID NO：1～2所示，再构建crRNA体外转录载体并进行体外转录和纯化，或者直接合成；

(2)针对步骤(1)所述的新冠病毒的非突变D614及突变靶点G614设计RT-RAA引物，引物序列如序列表SEQ ID NO：3～4所示，对待测核酸样品进行RT-RAA反应，获得RT-RAA反应产物；或者，针对步骤(1)所述的新冠病毒的非突变D614以及突变靶点G614设计RT-PCR引物，序列如序列表SEQ ID NO：5～6所示，对待测核酸样品进行RT-PCR反应，获得RT-PCR反应产物；

(3)将步骤(1)所述的纯化后的crRNA体外转录产物或合成的614-crRNA-W或614-crRNA-M分子、步骤(2)所述RT-RAA或者RT-PCR反应产物、LbaCas12a、报告单链DNA分子以适当比例混合于适当体系中进行反应；

(4)反应产物通过荧光或侧流免疫层析试纸检测获得检测结果。

4.根据权利要求3所述的用于新冠病毒D614G突变的检测方法，其特征在于：

步骤(3)中的报告单链DNA分子设计：用于侧流免疫层析试纸检测时，两端分别带有Digoxin和Biotin基团的12碱基随机序列单链DNA分子5′-Digoxin-NNNNNNNNNNNN-Biotin-3′，见SEQ ID NO：7；

用于荧光检测时，两端分别带有FAM和BHQ1基团的12碱基随机序列单链DNA分子5′-FAM-NNNNNNNNNNNN-BHQ1-3′，见SEQ ID NO：8。