[发明专利]一种基于PMA-双重ddPCR的副溶血性弧菌定量检测方法

说明书

本发明公开了一种基于PMA‑双重ddPCR的副溶血性弧菌定量检测方法，属于食品安全检测技术领域。本发明以副溶血性弧菌自筛特异性新靶点VP0488和传统靶点TLH为目的片段，设计并验证得到特异性引物和探针。同时，为保证方法的特异性和灵敏度，优化双重ddPCR扩增条件、反应体系以及PMA处理条件，建立了定量检测副溶血性弧菌活菌的PMA‑双重ddPCR方法。结果表明，本发明方法灵敏度高于双重实时荧光定量PCR(qPCR)，具有特异性强、准确性好的优点，在食品安全检测方面具有实际应用价值。

技术领域

本发明属于食品安全检测技术领域，具体涉及一种基于PMA-双重ddPCR的副溶血性弧菌定量检测方法。

背景技术

副溶血性弧菌(Vibrio parahemolyticus,Vp)是一类广泛分布于鱼类、贝类及虾蟹类等水产品中的杆状或弯曲状革兰氏阴性菌。饮用受污染的水以及食用生的或未煮熟的水产品会导致弧菌病的产生，尤其是免疫力低下的老人和小孩。据统计，每年美国由弧菌病导致的疾病达8万例，其中约4.5万由副溶血性弧菌引起。在我国，国家食品安全风险评估中心对全国食源性疾病暴发监测数据进行统计分析后发现，微生物性食源性疾病一直是引发我国食品安全问题的重要原因，其中副溶血性弧菌是最常见的食源性致病菌之一。目前，针对副溶血性弧菌的检测主要依赖于现行国家标准GB 4789.7-2013的检验方法，大体步骤包括前增菌、选择性培养基分离、纯培养、生化反应和血清型分型，整个流程一般需要5～7d。

当前，有关副溶血性弧菌快速检测方法的研究主要仍是以传统毒力因子、DNA旋转酶等作为特异性鉴定靶点建立起来的，由于副溶血性弧菌基因组包含两套染色体，在检测过程中，往往只检测其中1套染色体，再加上引物设计不当，在实际检测过程中常常存在误检的情况，影响结果的准确性。本实验室前期试验发现，在以tlh基因鉴定副溶血性弧菌时发现某些溶藻弧菌也能检测出tlh基因阳性。同样，也有技术人员发现某些哈维氏弧菌也能检测出tlh基因阳性，出现结果误判的情况。

微滴式数字PCR(ddPCR)是继普通PCR和实时荧光定量PCR(qPCR)之后的第三代PCR技术，是一项基于单分子目标基因PCR扩增的绝对定量技术。其原理是在PCR反应前将含有模板DNA的反应体系微滴化，把模板DNA分子分散在大约20000个“油包水”微滴中，使大部分微滴中只含有1个DNA分子数，PCR扩增后读取荧光信号(有荧光信号记为1，无荧光信号记为0)，依据泊松分布原理或阳性微滴的比例计算样本的起始浓度或拷贝数。与qPCR相比，ddPCR是终点检测，具有更高耐受性、灵敏度、准确性和精确度。

食物样品中除含有正常活菌细胞外，通常还携带有大量的死亡细胞，其DNA却能够稳定存在，而PCR技术是以核酸扩增为基础建立起来的，因此仅凭PCR技术无法区分活菌和死菌，易造成“假阳性”结果。叠氮溴化丙锭(PMA)是一种具有高亲和力的光敏性DNA结合染料，与叠氮溴化乙锭(EMA)均属于叠氮类染料，它们作用原理相似。活细胞的细胞膜完整，PMA被阻隔在胞外，不与核酸反应。非活细胞的细胞膜大多有不同程度损伤，PMA即可穿入破碎的细胞膜，与DNA发生不可逆共价交联，体系中残余的染料与水分子再经光照反应生成无活性的羟胺化合物，而不会对后续活细胞DNA扩增造成影响。

发明内容

由于副溶血性弧菌基因组包含两套染色体，在检测过程中，往往只针对其中1套染色体选择检测的靶基因，再加上引物设计不当，在实际检测过程中常常存在误检的情况，造成“假阴性”，影响结果的准确性，进一步导致食品安全隐患。

为了解决上述问题，本发明提供一种基于副溶血性弧菌自筛特异性新靶点VP0488和传统靶点TLH设计特异性引物和探针，并结合PMA去除死菌的特性，建立副溶血性弧菌PMA-双重ddPCR定量检测方法及应用，以弥补现有技术中的不足。

为实现上述目的，本发明的技术方案为：