[发明专利]一种基于PMA-双重ddPCR的副溶血性弧菌定量检测方法在审
| 申请号： | 202111153909.7 | 申请日： | 2021-09-29 |
| 公开（公告）号： | CN113637733A | 公开（公告）日： | 2021-11-12 |
| 发明（设计）人： | 杨军;周海波;刘新梅;别小妹;程逸宇;吴海晶;刘延 | 申请（专利权）人： | 南京市食品药品监督检验院 |
| 主分类号： | C12Q1/6851 | 分类号： | C12Q1/6851;C12Q1/689;C12Q1/06;C12N15/11 |
| 代理公司： | 哈尔滨市阳光惠远知识产权代理有限公司 23211 | 代理人： | 仇钰莹 |
| 地址： | 211198 江*** | 国省代码： | 江苏;32 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 一种 基于 pma 双重 ddpcr 溶血 弧菌 定量 检测 方法 | ||
1.一种检测试剂，其特征在于，包括引物组合A和引物组合B，
所述引物组合A包括上游引物，下游引物和探针，所述上游引物、下游引物和探针的序列如下所示：
上游引物：TTGAGTATTCAAGGTGCTTTGTAT；
下游引物：CATCAATCATCCACTCGGTAG；
探针：CTGCGAATTTGACTGCTGAGGCT；
所述探针的5’端用FAM修饰，3’端用BHQ1修饰；其中，FAM表示荧光报告基团，BHQ1表示淬灭基团；
所述引物组合B包括上游引物，下游引物和探针，所述上游引物、下游引物和探针的序列如下所示：
上游引物：GTGCGAAAGTGCTTGAGATG；
下游引物：TCGAACAAGGCGTGAGTATC；
探针：CGAGTTCATCAAGGCACAAGCGA；
所述探针的5’端用HEX修饰，3’端用BHQ1修饰；其中，HEX表示荧光报告基团，BHQ1表示淬灭基团。
2.一种检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1所述的检测试剂。
3.根据权利要求2所述的一种检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括ddPCR扩增反应所需的辅助试剂和叠氮溴化丙锭。
4.一种检测副溶血性弧菌的方法，其特征在于，所述方法为，使用PMA预处理待测样本，并利用权利要求1所述的检测试剂或权利要求2或3所述的检测试剂盒进行双重ddPCR。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述预处理为将PMA与待测样本混匀并避光孵育不少于5min后，光照处理不少于15min。
6.根据权利要求4或5所述的方法，其特征在于，所述PMA的终浓度为28～32μmol/L。
7.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述双重ddPCR的反应体系中，总体系为20μL，包括：ddPCR Supermix for Probes(No dUTP)10μL，引物组合A和引物组合B的上、下游引物各1.0μL，探针各0.5μL，DNA模板4μL，最后用水补足至20μL。
8.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述引物探针比例为1:0.25～1:2。
9.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述双重ddPCR的扩增条件为：95℃10min；94℃30s；58～62℃1min，40～60个循环；98℃10min；4℃保存。
10.权利要求1所述检测试剂、权利要求2或3所述检测试剂盒和权利要求4～9任一所述方法在食品卫生和环境监测中的应用。
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