[发明专利]一株高产Xcn1的嗜线虫致病杆菌及其应用

说明书

本发明涉及一株高产Xenocoumacin1(Xcn1)的嗜线虫致病杆菌，基于同源重组技术，对嗜线虫致病杆菌CB6野生型菌株中与Xcn1合成代谢相关的基因进行工程改造，获得不产Xcn2、高产Xcn1的菌株，最终获得一株命名为CB6‑T2的改良菌株，经研究发现所述CB6‑T2菌株内介导Xcn1降解转化的酶基因xcnM缺失突变，Xcn1合成基因簇的第一个基因xcnA启动子替换为来源于嗜线虫致病杆菌自身表达强度更高的启动子Promoter‑g3509。经试验发现菌株CB6‑T2，在LB培养基中发酵得到的Xcn1产量至少在782mg/L以上，远高于嗜线虫致病杆菌CB6野生型菌株的发酵产量。可以有效降低Xcn1产业化开发的生产成本。

技术领域

本发明涉及微生物技术领域，具体涉及一株高产Xcn1的嗜线虫致病杆菌菌株及其应用。

背景技术

昆虫病原线虫共生菌是存在于昆虫病原线虫肠道内的一类细菌，属肠杆菌科(Enterobacteriaceae)，包括与斯氏线虫属(Steinernema)线虫共生的致病杆菌属(Xenorhabdus)和与异小杆线虫属(Heterorhabditis)线虫共生的发光杆菌属(Photorhabdus)。共生菌分泌多种酶，降解昆虫组织，释放营养物质，并产生抑菌物质抑制其它杂菌生长，有助于线虫的生长繁殖。共生菌来源于特殊的生境，其代谢物中存在多种具有生物活性的新化合物，目前已分离鉴定的主要有抗菌物质、杀虫蛋白、抗癌物质等。

研究者前期分离收集到多株昆虫病原线虫共生细菌，通过对不同共生细菌的抑菌活性评价，发现在北京郊区分离到的嗜线虫致病杆菌CB6菌株(CGMCC No.1173，本研究室保存)的代谢产物具有很高的抑菌活性，对马铃薯晚疫病、番茄晚疫病和黄瓜白粉病等多种植物病害具有显著的防治效果。通过对CB6菌株发酵产物中的抗菌成份进行分离纯化和结构鉴定，确定Xenocoumacin1(Xcn1)是拮抗植物病害的主要活性物质。Xcn1是由精氨酸残基、亮氨酸残基和四个乙酸酯单元形成的异香豆素类衍生物，该化合物具有拮抗马铃薯晚疫病、番茄晚疫病、黄瓜白粉病和辣椒疫霉病等植物真菌病害的生物学功能。Xcn1是嗜线虫致病杆菌CB6产生的主要活性物质，但是在菌株代谢过程中，过量积累的Xcn1会激活Xcn1的降解代谢途径，Xcn1会被转化成Xcn2等低活性的衍生物，发酵生产得到的Xcn1随着时间的推进反而产量进一步下降，导致Xcn1无法大量积累。此外，野生型CB6菌株发酵产生Xcn1的水平较低，推测Xcn1合成基因簇中各种酶的表达水平较低是关键限制因素。

发明内容

基于以上技术缺陷，本发明的技术目的是提供一株高产Xenocoumacin1(Xcn1)的嗜线虫致病杆菌，基于同源重组技术，对嗜线虫致病杆菌CB6野生型菌株中与Xcn1合成代谢相关的基因进行工程改造，获得不产Xcn2、高产Xcn1的菌株，经技术优化后，最终获得一株命名为CB6-T2的Xcn1产量最高的菌株。经研究发现所述CB6-T2菌株内介导Xcn1降解转化的酶基因xcnM缺失突变，Xcn1合成基因簇的第一个基因xcnA启动子替换为来源于嗜线虫致病杆菌自身表达强度更高的启动子Promoter-g3509。

本发明先提供一株嗜线虫致病杆菌，其中所述酶基因xcnM首先以同源重组双交换的方式被缺失突变。具体以大肠杆菌-嗜线虫致病杆菌穿梭克隆载体pJQ200sk为骨架构建基因敲除载体，利用同源重组原理，通过双交换过程获得Xcn1降解途径被阻断，Xcn1高产的菌株。

在此基础上，进一步本发明还发现，在用同源重组基因敲除改造技术将嗜线虫致病杆菌CB6野生型菌株内介导Xcn1转化为Xcn2的酶基因xcnM以同源重组双交换的方式缺失突变后，再同样采用同源重组双交换方式，将Xcn1合成基因簇的第一个基因xcnA的启动子替换为来源于嗜线虫致病杆菌自身表达强度更高的启动子Promoter-g3509，可以获得更好的基因表达效果，Xcn1产量更高的技术效果。经试验发现，通过上述手段最终获得的嗜线虫致病杆菌CB6-T2，在LB培养基中发酵得到的Xcn1产量至少在782mg/L以上，远高于嗜线虫致病杆菌CB6野生型菌株的发酵产量71mg/L。可以有效降低Xcn1产业化开发的生产成本。