[发明专利]一种肿瘤特异性TIL细胞的培育分离方法

说明书

本发明提供一种肿瘤特异性TIL细胞的培育分离方法，包括以下步骤：步骤1，获取胸腹水中的肿瘤细胞团和免疫细胞液；步骤2，将肿瘤细胞团进行肿瘤类器官培养；步骤3，将免疫细胞进行扩增培养；步骤4，将培养获得的肿瘤类器官处理成单细胞后与扩增培养的免疫细胞进行共培养；步骤5：分离共培养细胞中的特定免疫细胞群。本发明利用同一来源的样本同时分离培养肿瘤类器官以及肿瘤相关免疫细胞，再将肿瘤类器官和免疫细胞进行共培养，得到的肿瘤特异性的TIL细胞可以保留类器官的生物学效应，并且数量多，培养周期明显缩短。此外，利用本方法分离培养得到的TIL细胞肿瘤特异性更强，由此肿瘤杀伤活性会更强。

技术领域

本发明涉及细胞培育技术领域，具体涉及一种肿瘤特异性TIL细胞的培育分离方法。

背景技术

肿瘤浸润性淋巴细胞(Tumor infiltrating lymphocytes，TILs)是存在于肿瘤组织、肿瘤转移淋巴结以及肿瘤相关恶性胸腹水的淋巴细胞。相较于血液或其他器官中的淋巴细胞，TIL细胞中含有较高比例的肿瘤特异性淋巴细胞。这一类淋巴细胞通过体外分离、扩增、活化后已作为一种临床治疗手段可用于肿瘤的过继性细胞免疫治疗，并在恶性黑色素瘤(melanoma)，急性淋巴性白血病(Acute lymphoblastic leukemia，ALL)等癌种中取得不菲的效果。然而这种过继性细胞免疫治疗手段在其他癌种中取得的疗效并不大，其中一个重要原因就是如何寻找到精准的已经识别肿瘤的TILs，同时从原理上来说：要是肿瘤的免疫原性很低，并不能够激活T细胞，那么这个疗法的效果就会大打折扣。基于此，找到或者激活并扩增肿瘤特异性TIL将是推进过继性细胞免疫治疗的一个重要进步。目前虽然已有人提出自肿瘤相关恶性胸腹水中提取TIL细胞分离、扩增，但是由于肿瘤特异性靶点不明确，筛选扩增得到的恶性胸水中肿瘤特异性TIL的生物学特性报道较少，已有报道的则满足不了要求。此外，培育过程的繁琐性和不稳定性也是阻碍研究进展的难题。

类器官(Organoids)是衍生于干细胞或前体细胞的器官特异性细胞集合。体外培养的类器官在细胞成分和组织架构上与对应器官高度相似，并具备相应的功能学特征。与常规细跑培养在二维环境中培养单一细胞类群不同，类器官培养是在三维环境中培养出特定组织器官包含的多种细胞类群，其培养体系与体内微环境更为相似。肿瘤类器官(tumoroid)是由肿瘤组织或肿瘤相关胸腹水培育而成的类器官，因此肿瘤类器官或可为激活、扩增肿瘤特异性TIL细胞提供需要的靶点刺激。如果能将类器官的生物学效应和TIL细胞进行有机结合，势必推动TILs识别肿瘤研究的巨大进展。

发明内容

针对现有技术存在的上述问题，本发明提供一种肿瘤特异性TIL细胞的培育分离方法。本发明的技术方案为：

一种肿瘤特异性TIL细胞的培育分离方法，包括以下步骤：

步骤1，获取胸腹水中的肿瘤细胞团和免疫细胞；

步骤2，将肿瘤细胞团进行肿瘤类器官培养；

步骤3，将免疫细胞进行扩增培养；

步骤4，将培养获得的肿瘤类器官处理成单细胞后与扩增培养的免疫细胞进行共培养；

步骤5：分离共培养细胞中的特定免疫细胞群，即得。

进一步地，所述步骤1中获取胸腹水中的肿瘤细胞团和免疫细胞的过程包括：获取胸腹水后，先50g–200g低速离心分离出肿瘤细胞团，再800g–1200g高速离心分离出免疫细胞。

进一步地，所述步骤2中将肿瘤细胞团进行肿瘤类器官培养的具体过程包括：

步骤2-1，将肿瘤细胞团用HBSS清洗后，加入等量Matrigel混匀；

步骤2-2，待细胞液凝固后，加入肿瘤类器官培养基于37℃、5％CO₂浓度下培养6～10天。