[发明专利]一种肿瘤特异性TIL细胞的培育分离方法

权利要求书

1.一种肿瘤特异性TIL细胞的培育分离方法，其特征在于：包括以下步骤：

步骤1，获取胸腹水中的肿瘤细胞团和免疫细胞；

步骤2，将肿瘤细胞团进行肿瘤类器官培养；

步骤3，将免疫细胞进行扩增培养；

步骤4，将培养获得的肿瘤类器官处理成单细胞后与扩增培养的免疫细胞进行共培养；

步骤5：分离共培养细胞中的特定免疫细胞群，即得。

2.根据权利要求1所述的一种肿瘤特异性TIL细胞的培育分离方法，其特征在于：所述步骤1中获取胸腹水中的肿瘤细胞团和免疫细胞的过程包括：获取胸腹水后，先50g-200g低速离心分离出肿瘤细胞团，再800g-1200g高速离心分离出免疫细胞。

3.根据权利要求1所述的一种肿瘤特异性TIL细胞的培育分离方法，其特征在于：所述步骤2中将肿瘤细胞团进行肿瘤类器官培养的具体过程包括：

步骤2-1，将肿瘤细胞团用HBSS清洗后，加入等量Matrigel混匀；

步骤2-2，待细胞液凝固后，加入肿瘤类器官培养基于37℃、5％CO₂浓度下培养6～10天。

4.根据权利要求3所述的一种肿瘤特异性TIL细胞的培育分离方法，其特征在于：所述肿瘤类器官培养基按照终浓度的组成包括：Glutamine，1～10mM；Nicotinamide，1～10mM；A83-01，0.1～5μM；Penicillin，20～200U/mL；Streptomycin，20～200μg/mL；SB-202190，1～10μM；EGF，20～200ng/mL；L-WRN细胞培养上清液，20-60％；溶剂为DMEM/F12培养基。

5.根据权利要求4所述的一种肿瘤特异性TIL细胞的培育分离方法，其特征在于：所述肿瘤类器官培养基按照终浓度的组成还包括：Gastrin，2～20nM；N-acetylcysteine，1～10mM；FGF-10，20～200ng/mL。

6.根据权利要求1所述的一种肿瘤特异性TIL细胞的培育分离方法，其特征在于：所述步骤3中将免疫细胞液进行扩增培养的具体过程包括：

步骤3-1，将免疫细胞用D-Hanks平衡盐溶液清洗后，加入人外周血淋巴细胞分离液分离单核细胞，得到包括免疫细胞的单细胞悬液；

步骤3-2，将单细胞悬液过40目滤网后加入含有1000-8000IU/mL的IL-2的X-VIVO^TM15培养基混匀，于37℃、5％CO₂浓度下扩增培养，扩增免疫细胞至5×10^6-5×10^8。

7.根据权利要求1所述的一种肿瘤特异性TIL细胞的培育分离方法，其特征在于：所述步骤4中将培养获得的肿瘤类器官处理成单细胞后与扩增培养的免疫细胞进行共培养，具体过程包括：

步骤4-1，将肿瘤类器官通过消化液消化得到单细胞悬液；

步骤4-2，将肿瘤类器官单细胞与扩增培养得到的免疫细胞按照1∶2-1∶20细胞比例混匀，加入含有1000-8000IU/mL的IL-2的X-VIVO^TM15培养基，于37℃、5％CO₂浓度下培养3-9天，分离后获得一次培养的免疫细胞；

步骤4-3，转移一次培养的免疫细胞至新的培养皿，按照1∶2-1∶20细胞比例添加肿瘤类器官单细胞混匀，加入含有1000-8000IU/mL的IL-2的X-VIVO^TM15培养基，于37℃、5％CO₂浓度下培养3-9天。

8.根据权利要求1或7所述的一种肿瘤特异性TIL细胞的培育分离方法，其特征在于：所述步骤5是采用细胞磁珠分选方法分离共培养细胞中的特定免疫细胞群，具体包括：

步骤5-1，将步骤4获得的共培养物中的免疫细胞沉淀分离出来，采用D-Hanks平衡盐溶液重悬免疫细胞，加入X-VIVO^TM15培养基混匀；

步骤5-2，采用生物素标记试剂标记细胞混合液中的CD45+细胞；

步骤5-3，标记完毕，将细胞混合液加入细胞分选柱中，利用磁性分离器收集CD45+免疫细胞。