[发明专利]魏氏柠檬酸杆菌ansB基因敲除突变株及其应用

说明书

本发明公开了魏氏柠檬酸杆菌ansB基因敲除突变株及其应用。它是敲除了ansB基因的魏氏柠檬酸杆菌，所述的ansB基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明所得到的敲除魏氏柠檬酸杆菌ansB基因的工程菌，在25°C和30°C，以及LB、TSB和NB等培养基中培养，提高了其在聚苯烯材料上的生物被膜形成能力，从而拓宽了魏氏柠檬酸杆菌用于重金属离子吸附和构建细胞蛋白合成微工厂等的应用场景和范围。

技术领域

本发明属于基因工程领域，具体涉及魏氏柠檬酸杆菌ansB基因敲除突变株及其应用。

背景技术

柠檬酸杆菌属的细菌，营化能有机营养，能利用柠檬酸盐作为唯一碳源生长，因此得名。该属的细菌都是革兰氏阴性菌，通常周生鞭毛，兼性厌氧，有呼吸和发酵两种类型的代谢方式，发酵葡萄糖产酸产气。该属的细菌常发现于人和动物的粪便，可能是正常肠道栖居菌，也见于土壤、水、污水和食物中，但也时常作为条件性致病菌分离自临床样品。近年来，该属的细菌被广泛的应用于重金属离子吸附和污水处理等污染环境治理等领域，而该属的典型代表魏氏柠檬酸杆菌，具备柠檬酸杆菌属的典型特点，并且，由于该种属细菌全基因组的测定完成以及基于基因工程手段技术的进步，从基因水平对魏氏柠檬酸杆菌进行必要的干预和改造，使其具备更加优良的表型，如通过敲除其中的ompA基因使其具备更好的生物被膜形成能力和对杀菌剂的抗药性（专利：一种提高魏氏柠檬酸杆菌生物被膜形成的方法），已经成为一种切实可行的手段。

ansB基因是一种编码Ⅱ类谷氨酰胺酶/天冬酰胺酶的基因，其主要的作用是催化L-天冬酰胺水解成天冬氨酸和氨，该基因的转录受到cAMP受体蛋白（CRP）和FNR基因产物FNR蛋白的正调控；已经有研究证实ansB是单顺反子，即该基因只编码一个蛋白，并且该基因的表达依赖于σ⁵⁴；另外，有报道称，在鼠伤寒沙门氏菌中，ansB是抑制T细胞增殖、细胞因子产生以及下调T细胞受体表达所必需的；ansB用来治疗急性淋巴细胞白血病的机制，可能涉及白血病细胞的氨基酸饥饿；另外，该基因还对人类病原体如空肠弯曲杆菌、幽门螺杆菌和鼠伤寒沙门氏菌在宿主中的定植具有一定的影响。而魏氏柠檬酸杆菌中的ansB基因，全长1047bp，编码的蛋白有348个氨基酸序列，该基因在魏氏柠檬酸杆菌中可能具有重要的功能，也可以使用基因工程等手段对其进行开发利用。

而自然界中的大部分细菌往往都不是以单个的细胞（个体）存在，而是互相聚集，以生物被膜的形式生存和生长，生物被膜作为一个细菌的聚集群体，其结构构成主要包括：水、菌体、胞外多聚物、蛋白和遗传物质，如eDNA和RNA等，并且，具有比单个的个体更优良的表型，如抵抗外界营养和环境胁迫能力增加，而更为重要的是，由于生物被膜具有三维立体结构，具有很多的孔道和比表面积，具有更好的吸附能力，同时具有自我修复和再植能力，已经成为在环境污染治理和蛋白合成微工厂等领域应用的重要材料和载体。但上述应用必须以菌体能够形成足够多的生物被膜为基础，而如何提高生物被膜的形成量，一直是一个科研的难点和热点，另外，生物被膜的形成也受到外界营养和环境条件的影响和制约，寻找最佳的生物被膜形成条件，也应引起足够的重视。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术中魏氏柠檬酸杆菌在特定条件下生物被膜形成能力有限的不足，提供一种提高魏氏柠檬酸杆菌生物被膜形成能力的魏氏柠檬酸杆菌ansB基因敲除突变株，从而提高其在环境治理和蛋白合成微工厂等方面的应用潜力。