[发明专利]魏氏柠檬酸杆菌ansB基因敲除突变株及其应用

权利要求书

1.魏氏柠檬酸杆菌(Citrobacter werkmanii)ΔansB，其保藏编号为：GDMCCNo.61849。

2.一种提高魏氏柠檬酸杆菌生物被膜形成能力的方法，其特征在于，是敲除魏氏柠檬酸杆菌的ansB基因，提高魏氏柠檬酸杆菌生物被膜形成能力，所述的魏氏柠檬酸杆菌是魏氏柠檬酸杆菌GDFMZ BF-8，其保藏编号为：GDMCC No.61858，所述的ansB基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，PCR扩增ansB基因的上下游同源片段，将其与质粒pYG4连接构建敲除载体pYG4-ansB，然后转化大肠杆菌S17-1；将携带有敲除载体pYG4-ansB的大肠杆菌S17-1与魏氏柠檬酸杆菌接合转移，获得敲除ansB基因的魏氏柠檬酸杆菌ansB基因敲除突变株。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，具体步骤为：

(1)引物序列：

ansB-up-F：aaaagtgccacctgcagatctTTCGATATTTGGTGGGACTAAGTAGC

ansB-up-R：gccacctgcatcgaGTTATTTCTCCAGTTACTTGAATTTGC

ansB-down-F：aataacTCGATGCAGGTGGCTGCG

ansB-down-R：agtcatatgccgcggagatctCGGTCTGGGGCTACGTAGC

ansB-QJ-F：CGCTGGAAAACGATCGTAAAAC；

ansB-QJ-R：CAAGCCGTTCGAGTTCTTTATG；

(2)以提取的魏氏柠檬酸杆菌基因组DNA作为模板，分别以ansB-up-F和ansB-up-R，ansB-down-F和ansB-down-R为引物，扩增得到ansB基因的上下游同源序列；

(3)用BglII单酶切pYG4质粒，并割胶回收；

(4)将扩增得到的ansB基因的上下游同源片段连接到质粒pYG4上，构建敲除载体pYG4-ansB，然后热激转化大肠杆菌S17-1；

(5)将携带有敲除载体pYG4-ansB的大肠杆菌S17-1与魏氏柠檬酸杆菌共孵育，将共孵育物洗脱下来，稀释后涂布于卡那霉素和利福平抗性筛选LB平板，用敲除鉴定引物ansB-QJ-F和ansB-QJ-R鉴定ansB基因一次交换重组子；

(6)然后将一次交换重组子用LB液体培养基扩大培养并稀释后涂布到含质量分数5％蔗糖的LB平板上，挑取单克隆，使用敲除鉴定引物ansB-QJ-F和ansB-QJ-R鉴定获得敲除ansB基因的魏氏柠檬酸杆菌ansB基因敲除突变株。

5.权利要求1的魏氏柠檬酸杆菌ΔansB在吸附重金属离子或蛋白合成微工厂中的应用。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，是在以聚苯烯附着材料、LB培养基、30℃和静置培养的条件下进行应用。