[发明专利]一种用于检测橡胶树胶孢炭疽菌的LAMP引物组及其检测方法和应用

说明书

本发明公开了一种用于检测橡胶树胶孢炭疽菌的LAMP引物组及其检测方法和应用，引物组包括外引物Tub‑F3、外引物Tub‑B3、内引物Tub‑FIP和内引物Tub‑BIP；检测橡胶树胶孢炭疽菌的方法包括提取DNA、LAMP扩增和结果判定；本发明成功建立了一个特异性强、灵敏度高的LAMP检测方法，LAMP引物组特异性识别橡胶树胶孢炭疽菌，且对不同的菌株均具有良好的识别能力，可用于橡胶树胶孢炭疽菌的种属鉴定；本发明公开的LAMP反应体系灵敏度高，在人工侵染和田间自然发病条件的叶片中均能检出病原菌，可被用于监测橡胶树胶孢炭疽菌从潜伏侵染到发病的生长全过程，大大提高了田间检测的应用范围。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种用于检测橡胶树胶孢炭疽菌的LAMP引物组及其检测方法和应用。

背景技术

橡胶树(Hevea brasiliensis)是一种具有重要经济价值的热带林木。全球超过98％的天然橡胶均来源于橡胶树，该产业的健康发展具有重大的战略意义。由胶孢炭疽菌复合群(Colletotrichum gloeosporioides)的暹罗刺盘孢菌(C.siamense)和果生刺盘孢菌(C.fructicola)引起的炭疽病是我国橡胶树的主要病害之一，病原物可侵染橡胶树叶、花、枝条等多个组织，造成叶枯、落叶，导致天然橡胶严重减产。胶孢炭疽菌具有潜伏侵染特性，一旦环境条件适宜便能短时间内爆发成灾，造成严重的经济损失，因此亟需开发橡胶树胶孢炭疽菌的早期检测技术。

炭疽菌种类繁多，遗传多态性丰富，常规的形态学鉴定方法步骤繁琐且难以鉴定到种，满足不了目前快速、准确、灵敏的鉴定需求。基于实时荧光定量PCR的橡胶树胶孢炭疽菌检测技术虽然灵敏度高、特异性强，但需要昂贵的仪器设备和试剂，不利于基层推广应用。环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)是近年发展起来的一种新型检测技术，因具有特异性强、灵敏度高、操作简单、仪器需求低、速度快反应等优点，被广泛应用于微生物快速检测。LAMP是一个单步扩增过程，可以避免复杂的DNA提纯程序，在植物病原菌的早期检测中有良好的应用潜力。目前LAMP技术已成功应用于大豆炭疽病菌C.truncatum、辣椒炭疽病菌C.capsici、草莓炭疽病菌C.gloeosporioides和C.acutatum、番石榴炭疽病菌C.gloeosporioides等炭疽菌的检测，国内外尚未见橡胶树炭疽病菌检测研究的报道。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的缺点，提供一种用于检测橡胶树胶孢炭疽菌的LAMP引物组；

本发明的第二目的在于提供一种用于检测橡胶树胶孢炭疽菌的试剂盒；

本发明的第三目的在于提供一种特异性强、灵敏度高的检测橡胶树胶孢炭疽菌的方法。本发明的目的通过以下技术方案来实现：一种用于检测橡胶树胶孢炭疽菌的LAMP引物组，其包括外引物Tub-F3、外引物Tub-B3、内引物Tub-FIP和内引物Tub-BIP，其中，所述外引物Tub-F3的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述外引物Tub-B3的核苷酸序列如SEQ IDNO.2所示，所述内引物Tub-FIP的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述内引物Tub-BIP的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

一种用于检测橡胶树胶孢炭疽菌的试剂盒，包含所述的LAMP引物组。

进一步地，所述试剂盒中含包括LAMP反应试剂。

所述的LAMP引物组及所述的试剂盒在检测橡胶树胶孢炭疽菌中的应用。

一种检测橡胶树胶孢炭疽菌的方法，它包括以下步骤：

S1.提取DNA：提取待检测橡胶树胶孢炭疽菌叶片的DNA；

S2.LAMP扩增：将步骤S1提取的DNA为模板，用上述的引物组进行LAMP扩增；