[发明专利]盐湖浮游病毒快速荧光显微计数方法

说明书

本发明公开了一种盐湖浮游病毒快速荧光显微计数方法，包括样品采集、杂质祛除、二次离心、酶解游离核酸、染色、镜检以及计数等步骤。本发明祛除盐湖样本中杂质，使得水系中浮游病毒易观察。

技术领域

本发明涉及浮游病毒快速荧光显微计数技术领域，具体来说，涉及一种盐 湖浮游病毒快速荧光显微计数方法。

背景技术

荧光显微镜计数病毒是在直接计数细菌技术上的变更。病毒壳内的核酸被 核酸染料染色,病毒被过滤到小孔径(≤0.02μm)滤膜上,用高倍镜观察。

针对水系样本，均采用常规检测计数方法。此方法自90年代初期沿用至 今。但针对不同水系样本的处理均无特殊化的方法优化。

目前，针对盐湖等溶质丰富的水系样本，祛除水系中的溶质和杂质可以更 明确地观察和计数浮游病毒，但溶质、杂质去除过程可能会损失大量的浮游病 毒，因此溶质和杂质祛除是盐湖样本浮游病毒计数的关键技术难点。

发明内容

针对相关技术中的问题，本发明提出一种盐湖浮游病毒快速荧光显微计 数方法，以克服现有相关技术所存在的上述技术问题。

为此，本发明采用的具体技术方案如下：

一种盐湖浮游病毒快速荧光显微计数方法，包括如下步骤，

步骤S100：样品采集，使用无菌收集瓶浸入盐湖水面以下取出水样，立即 加入戊二醛并置于4℃环境中避光固定保存；

步骤S200：杂质祛除，在4℃环境中，用高速离心机离心处理步骤步骤S100 保存的样品，弃沉淀，取上清液，其中高速离心机转速为4000r/min，离心 时间为5～10min；

步骤S300：二次离心，在4℃环境中，用高速离心机继续离心处理步骤S200 所得上清液5～10min，弃沉淀，继续取上清液，然后用滤膜过滤得最终上 清液，其中高速离心机转速为6000r/min；

步骤S400：酶解游离核酸，取步骤S300所得上清液，放入无菌离心管， 加入RNaseA和DNase I，静置20～30min；之后使用滤膜过滤，得过滤液；

步骤S500：染色，取步骤S400中的过滤液加入1x SYBR Green I，避光染 色10～15min；再使用滤膜过滤，然后滤膜过滤抗腿色剂；

步骤S600：镜检，将步骤S500得到的滤膜放置载玻片上，根据荧光强度、 颗粒大小区分细菌与病毒，随机挑选若干视野进行计数。

优选的，步骤S100中盐湖水样与戊二醛的体积比为9：1。

根据权利要求2所述的一种盐湖浮游病毒快速荧光显微计数方法，其特征 在于，还包括步骤S700：计数，计数结果取平均值后根据稀释倍数、视野面 积、过滤面积计算浮游病毒的丰度；

计算公式如下:

其中，A为浮游病毒的丰度，单位为个/mL，n为单个视野下浮游病毒的 平均数量，单位为个，Sm为滤膜面积，单位为mm2，Sf为显微视野面积，单 位为mm2，d为计数样品稀释倍数。

优选的，所述滤膜为0.22μm的醋酸纤维滤膜。

优选的，所述步骤S600具体为将步骤S500得到的滤膜放置载玻片上，在 10×100倍的油镜下利用494nm蓝色激发光观察；根据荧光强度、颗粒大小 区分细菌与病毒，随机挑选5个视野进行计数。

优选的，步骤S400中RNase A、DNase I的体积比分别为10000:1、5000:1。

优选的，步骤S500中1x SYBR Green I的体积比为40:1。