[发明专利]盐湖浮游病毒快速荧光显微计数方法

权利要求书

1.一种盐湖浮游病毒快速荧光显微计数方法，其特征在于，包括如下步骤，

步骤S100：样品采集，使用无菌收集瓶浸入盐湖水面以下取出水样，立即加入戊二醛并置于4℃环境中避光固定保存；

步骤S200：杂质祛除，在4℃环境中，用高速离心机离心处理步骤步骤S100保存的样品，弃沉淀，取上清液，其中高速离心机转速为4000r/min，离心时间为5～10min；

步骤S300：二次离心，在4℃环境中，用高速离心机继续离心处理步骤S200所得上清液5～10min，弃沉淀，继续取上清液，然后用滤膜过滤得最终上清液，其中高速离心机转速为6000r/min；

步骤S400：酶解游离核酸，取步骤S300所得上清液，放入无菌离心管，加入RNase A和DNase I，静置20～30min；之后使用滤膜过滤，得过滤液；

步骤S500：染色，取步骤S400中的过滤液加入1x SYBR Green I，避光染色10~15min；再使用滤膜过滤，然后滤膜过滤抗腿色剂；

步骤S600：镜检，将步骤S500得到的滤膜放置载玻片上，根据荧光强度、颗粒大小区分细菌与病毒，随机挑选若干视野进行计数。

2.根据权利要求1所述的一种盐湖浮游病毒快速荧光显微计数方法，其特征在于，步骤S100中盐湖水样与戊二醛的体积比为9：1。

3.根据权利要求2所述的一种盐湖浮游病毒快速荧光显微计数方法，其特征在于，还包括步骤S700：计数，计数结果取平均值后根据稀释倍数、视野面积、过滤面积计算浮游病毒的丰度；

计算公式如下:

其中，A为浮游病毒的丰度，单位为个/mL，n为单个视野下浮游病毒的平均数量，单位为个，Sm为滤膜面积，单位为mm²，Sf为显微视野面积，单位为mm²，d为计数样品稀释倍数。

4.根据权利要求1-3任一项所述的一种盐湖浮游病毒快速荧光显微计数方法，其特征在于，所述滤膜为0.22μm的醋酸纤维滤膜。

5.根据权利要求1-3任一项所述的一种盐湖浮游病毒快速荧光显微计数方法，其特征在于，所述步骤S600具体为将步骤S500得到的滤膜放置载玻片上，在10×100倍的油镜下利用494 nm蓝色激发光观察；根据荧光强度、颗粒大小区分细菌与病毒，随机挑选5个视野进行计数。

6.根据权利要求1-3任一项所述的一种盐湖浮游病毒快速荧光显微计数方法，其特征在于，所述步骤S400中RNase A、DNase I的体积比分别为10000:1、5000:1。

7.根据权利要求1-3任一项所述的一种盐湖浮游病毒快速荧光显微计数方法，其特征在于，所述步骤S500中1x SYBR Green I的体积比为40:1。

8.根据权利要求1-3任一项所述的一种盐湖浮游病毒快速荧光显微计数方法，其特征在于，所述步骤S500中抗腿色剂体积比15:1。