[发明专利]一种能够大量表达南极假丝酵母脂肪酶B的黑曲霉重组菌株及其构建方法及应用

说明书

本发明公开了高产脂肪酶B的黑曲霉重组表达菌株及其构建方法和应用。一种构建重组黑曲霉表达菌的方法，构建包含脂肪酶B的重组表达盒，该重组表达盒为包含脂肪酶B基因序列、启动子、终止子、筛选标记、上下游同源序列等元件的基因片段。按照本发明所述的方法构建的产脂肪酶B黑曲霉重组表达菌株。本发明所述的产脂肪酶B黑曲霉重组表达菌株在表达脂肪酶B中的应用。本发明通过基因工程的手段，构建了脂肪酶B的表达盒，并将其导入黑曲霉表达宿主菌，实现了脂肪酶B的高效分泌表达，获得了高产脂肪酶B表达菌株。通过对发酵条件的优化，该菌株液体发酵的上清液粗酶液表达水平可达4g/L。脂肪酶B合成性酶活可达10600unit/L。

技术领域

本发明属于基因工程育种领域，涉及一种高产脂肪酶B黑曲霉重组表达菌株的构建及应用。

背景技术

脂肪酶B是一种具有双重脂类催化作用的生物催化剂。首先，脂肪酶B能够催化脂类水解，分解成醇类和脂肪酸类。其次，脂肪酶B在特定的条件下，还能够催化醇类和脂肪酸类物质脱水缩合，生成脂类。同时，在特定的条件下，它还可以催化脂类物质同相应的酸类物质或者醇类物质发生转酯化反应，生成新的脂类物质。因此，其与常规水解型脂肪酶是不同的。其被应用干酪制造、脂类改性、脂类水解，医药中间体生产，食品加工，生物柴油和润滑油生产等多种工业生产中。然而，由于其表达量相对较低，导致其价格较高，限制了其在工业界的广泛应用。因此，开发一种能够大量生产脂肪酶B的方法成为工业界的迫切需求。

脂肪酶B的生产来源主要是微生物发酵表达。然而，目前的发酵表达水平相对较低。比如，在《南极假丝酵母脂肪酶b高效表达及在选择性酰化方面的应用研究》中，表达量仅仅为0.24g/L。黑曲霉作为非常高效的工业生物发酵菌株，被用来表达一些需求量很大的工业化酶，比如糖化酶等。因此，使用黑曲霉表达脂肪酶B成为一种有潜在的高产可能性的工业化生产方法。然而，目前报道的使用黑曲霉作为宿主进行脂肪酶B表达的研究，表达量仍然很低(请参考：2019年文献《南极假丝酵母脂肪酶B在黑曲霉中的分泌表达及其硅藻土固定化应用》)。因此，发明一种能够更加高效的生产脂肪酶B的黑曲霉表达菌株，就显得尤为重要。

发明内容

本发明开发的使用黑曲霉作为宿主表达脂肪酶B的方法，以及相应的黑曲霉改造方法，实现了大量表达脂肪酶B的目标。表达量达到4g/L。合成性活性更是达到10600unit/L。

本发明提供了一种构建脂肪酶B重组黑曲霉表达菌株的方法。

本发明还提供了一种脂肪酶B重组表达载体。

本发明的目的可以通过以下技术方案实现：

一种构建重组黑曲霉表达菌的方法，构建包含脂肪酶B基因序列的重组表达盒，该重组表达盒为包含脂肪酶B基因序列、启动子、终止子、信号肽、筛选标记等元件的基因片段。

所述的脂肪酶B基因为曲霉、或青霉属来源脂肪酶B酶基因；优选为南极假丝酵母来源脂肪酶B基因；更进一步优选为具有如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列；所述的宿主细胞为黑曲霉。

启动子可以是黑曲霉内源启动子：如黑曲霉糖化酶启动子，中性淀粉酶启动子，酸性淀粉酶启动子，α-葡萄糖苷酶启动子等；也可以是外源启动子：如米曲霉中性淀粉酶启动子，米根酶糖化酶启动子；本发明优选黑曲霉糖化酶启动子或黑曲霉中性淀粉酶启动子。

与启动子3’末端连接的可以是调控序列：如合适的前导序列(5’UTR)，即对于宿主细胞的翻译重要的mRNA非翻译区，如米曲霉中性淀粉酶和构巢曲霉丙糖磷酸异构酶前导序列。

为了分泌表达特定蛋白，需要信号肽序列介导，在黑曲霉中常用的信号肽序列有糖化酶信号肽，酸性淀粉酶信号肽，黑曲霉植酸酶信号肽，米曲霉TAKA淀粉酶信号肽，在本发明中利用的是脂肪酶B基因序列本身编码的信号肽。

优选的终止子从如下酶的基因获得：黑曲霉糖化酶、米曲霉TAKA淀粉酶、构巢曲霉邻氨基苯甲酸合酶、黑曲霉α-葡糖苷酶和尖镰孢胰蛋白酶样蛋白酶。