[发明专利]一种能够大量表达南极假丝酵母脂肪酶B的黑曲霉重组菌株及其构建方法及应用

权利要求书

1.一种产脂肪酶B的黑曲霉重组表达菌株的构建方法，其特征在于以黑曲霉为宿主细胞，将含有脂肪酶B基因的表达盒导入到宿主细胞得到；所述的脂肪酶B基因选自曲霉、酵母或毛霉属来源的脂肪酶B基因。

2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述的脂肪酶B基因，为南极假丝酵母来源，其序列如SEQ ID NO.1所示。以及与SEQ ID NO.1同源性达到90％及以上的其他序列。

3.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于所述的表达盒为包含脂肪酶B基因序列、启动子、与启动子3’末端连接的调控序列、终止子、筛选标记和上下游同源序列的基因片段。

4.根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于所述的启动子选自黑曲霉内源启动子或外源启动子；所述的黑曲霉内源启动子为黑曲霉糖化酶启动子，中性淀粉酶启动子，酸性淀粉酶启动子或α-葡萄糖苷酶启动子；所述的外源启动子为米曲霉中性淀粉酶启动子或米根酶糖化酶启动子；所述的启动子3’末端连接的调控序列为前导序列5’UT。

5.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于所述的表达盒还包含信号肽序列，所述的信号肽序列选自有糖化酶信号肽、酸性淀粉酶信号肽、黑曲霉植酸酶信号肽或米曲霉TAKA淀粉酶信号肽，优选脂肪酶B基因序列本身编码的信号肽，如SEQ ID NO.2所示，以及与SEQ ID NO.2同源性达到95％及以上的其他序列。

6.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于所述的终止子从如下酶的基因中获得：黑曲霉糖化酶、米曲霉TAKA淀粉酶、构巢曲霉邻氨基苯甲酸合酶、黑曲霉α-葡糖苷酶或尖镰孢胰蛋白酶样蛋白酶。

7.根据权利要3所述的构建方法，其特征在于所述的筛选标记元件选自选择性标记和/或反向选择标记；所述的选择性标记选自乙酰胺酶amdS、鸟氨酸氨甲酰基转移酶argB、草铵膦bar、乙酰转移酶、潮霉素磷酸转移酶hyg、硝酸还原酶niaD、乳清酸核苷-5’-磷酸脱羧酶pyrG、硫酸腺苷酰转移酶sC、邻氨基苯甲酸合酶trpC或它们的等同物，优选用在曲霉属细胞中的是构巢曲霉或米曲霉的amdS、hyg；所述的反向选择标记选自丝状真菌宿主细胞的选择性标记或hsvTK，优选乙酰胺酶amdS、乳清酸核苷-5’-磷酸脱羧酶pyrG。

8.根据权利要求1-8中任一项所述的构建方法，其特征在于所述的脂肪酶B基因的表达盒核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示，以及与SEQ ID NO.7同源性达到95％及以上的其他序列。

9.根据权利要求1和要求3所述的构建方法，其特征在于所述的表达盒通过常规方法导入，随机插入到宿主黑曲霉基因组中，或定点整合到宿主黑曲霉的某个或多个基因座上。所述的基因座选自糖化酶gla，中性淀粉酶amya，中性淀粉酶amyb，酸性淀粉酶aa,α葡萄糖苷酶agda或α葡萄糖苷酶agdb中的任意一张。

10.根据权利要1所述的构建方法，其特征在于所述的宿主为敲除糖化酶基因、真菌淀粉酶基因和酸性淀粉酶基因的黑曲霉。

11.按照权利要求1-10中任一项所述的方法构建的产脂肪酶B黑曲霉重组表达菌株。