[发明专利]一种提高番茄植株抗病性的基因及其方法

权利要求书

1.一种提高番茄植株抗病性的基因，其特征在于：所述基因的核苷酸序列如Seq No.1所示。

2.一种提高番茄植株抗病性的方法，其特征在于：包括下列步骤：

步骤1：以番茄cDNA为模板，以第一轮引物进行第一轮PCR扩增，然后以第一轮PCR扩增产物为模板，以第二轮引物进行第二轮PCR扩增，纯化后得到第二轮PCR扩增产物；第一轮引物包括：

第一轮正向引物-F1：5’-AGAGATAGACATTTACAGGCTTCA-3’；

第一轮反向引物-R1：5’-TTGAACACTAATCAACTGATACAGG-3’；

第二轮引物包括：

第二轮正向引物-F2：5’-CGCGGATCCATAAATTTCATCAATGGCGTCGTTG-3’；

第二轮反向引物-R2：5’-CCGCTCGAGATCAACTGATACAGGTTGCATGTTT-3’；

步骤2：用限制性内切酶BamHI和限制性内切酶XhoI对载体pBI121和第二轮PCR扩增产物分别进行双酶切，酶切产物纯化后，得到线性pBI121载体和目的基因片段；

步骤3：目的基因片段和线性pBI121载体进行连接，得到CAS1-pBI121质粒；

步骤4：将CAS1-pBI121质粒转化至EHA105农杆菌感受态细胞；

步骤5：含有CAS1-pBI121质粒的EHA105农杆菌感受态细胞侵染番茄子叶并获得转基因阳性苗。

3.根据权利要求2所述的提高番茄植株抗病性的方法，其特征在于：步骤1中，第一轮PCR扩增体系为50μL，其中含有4μL的番茄cDNA，1μL的第一轮正向引物-F1，1μL的第一轮反向引物-R1，4μL的dNTP，1μL的高保真DNA聚合酶，10μL的5×pfu buffer，29μL的无菌ddH₂O；扩增参数为：95℃预变性5min，95℃变性20s，55℃退火20s，72℃延伸85s，38个循环，72℃延伸5min，4℃保存；第二轮PCR扩增体系为50μL，其中含有4μL的第一轮PCR扩增产物，1μL的第二轮正向引物-F2，1μL的第二轮反向引物-R2，4μL的dNTP，1μL的高保真DNA聚合酶，10μL的5×pfu buffer，29μL的无菌ddH₂O；扩增参数为：95℃预变性5min，95℃变性20s，55℃退火20s，72℃延伸1min25s，38个循环，72℃延伸5min，4℃保存；第二轮PCR扩增产物使用普通DNA纯化试剂盒进行纯化回收。

4.根据权利要求2所述的提高番茄植株抗病性的方法，其特征在于：步骤2中，载体pBI121酶切总体系为50μL，其中含有20μL的载体pBI121，2μL的限制性内切酶XhoI，2μL的限制性内切酶BamHI，5μL的Cut smart buffer，21μL的无菌ddH₂O；在37℃条件下酶切4h，然后使用DNA胶回收试剂盒对得到的酶切产物进行切胶纯化，得到线性pBI121载体；第二轮PCR扩增产物的酶切总体系为50μL，其中含有20μL的第二轮PCR扩增产物，2μL的限制性内切酶XhoI，2μL的限制性内切酶BamHI，5μL的Cut smart buffer，21μL的无菌ddH₂O；37℃条件下酶切过夜，然后使用DNA胶回收试剂盒对得到的酶切产物进行切胶纯化，得到目的基因片段。