[发明专利]一种用于鉴别猪源性成分的RPA引物及检测体系和方法

说明书

本发明公开了一种用于鉴别猪源性成分的RPA引物及检测体系和方法。本发明所述RPA引物和crRNA探针的特异性强，基于二者所构建的鉴别方法具有双重特异性，不会对其他物种进行非特异性识别，检测结果准确。同时，本发明所述猪源性成分鉴别方法的操作简便，所需时间短，结果准确，适用于一线检测人员对猪源性成分的现场快速检测。此外，本发明所述检测方法结合CTAB法提取样品核酸，对牛肉制品中掺杂的猪源性成分检测限可达0.001％(w/w)，适用于多种肉类加工产品中猪源性成分鉴别检测，适用范围广、可靠性高。

技术领域

本发明属于食品检验技术领域。更具体地，涉及一种用于鉴别猪源性成分的 RPA引物及检测体系和方法。

背景技术

传统的感官分辨方法已经无法满足肉质品种的鉴别需求。

目前，对于肉制品中动物物种的定性检测方法主要集中在代谢物以及核酸和蛋白的检测。其中，基于核酸的分子生物学检测方法因其具有灵敏度高、特异性强等优点，已成为肉类物种鉴别技术的研究热点。在所有动物源性成分的检测技术中，目前主要存在PCR-RFLP分析、PCR-RAPD分析、核酸探针杂交、PCR 等检测技术。国内出台的猪源性成分相关检测标准也主要集中在常规PCR和实时荧光PCR技术。这些标准检测方法非常依赖于PCR仪和实时荧光PCR仪等大型贵重实验室仪器设备，检测时间长，操作复杂，专业性要求较高，很难在低资源的肉制品检测一线进行推广应用。

近年来，DNA恒温扩增技术的发展为核酸的现场快速检测提供了可能。目前，DNA恒温扩增技术在动物源性成分的检测方面已有相关报道，例如，中国专利CN104988233A公开了一种利用线粒体DNA鉴别牛羊肉中狗肉的LAMP 检测方法，但LAMP扩增技术容易引起交叉反应和非特异性扩增，易出现假阳性现象，导致检测结果的准确性和稳定性不足。中国专利CN107385079A公开了 PCR和RPA扩增方式检测牛、羊、鸡、鸭和猪肉成分的方法以及引物组和试剂盒，采用RPA(Recombinase Polymerase Amplification)恒温扩增技术进行快速检测，但其需要结合核酸电泳来实现判别，操作复杂，并不适用于现场快速检测。

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服现有上述技术的缺陷和不足，提供一种用于鉴别猪源性成分的RPA引物及检测体系和方法。

本发明的第一个目的是提供一种用于鉴别猪源性成分的RPA引物。

本发明的第二个目的是提供所述RPA引物在鉴别猪源性成分或制备鉴别猪源性成分的产品中的应用。

本发明的第三个目的是提供一种用于鉴别猪源性成分的CRISPR/Cas12a检测体系。

本发明的第四个目的是提供所述检测体系在鉴别猪源性成分或制备鉴别猪源性成分的产品中的应用。

本发明的第五个目的是提供一种快速鉴别肉或肉制品中猪源性成分的方法。

本发明的第六个目的是提供一种用于鉴别猪源性成分的试剂盒。

本发明上述目的通过以下技术方案实现：

本发明以猪线粒体DNA为靶标，通过对9个不同品种的猪的线粒体DNA 进行同源性比对分析，同时与9个其他常见动物物种的线粒体DNA进行同源性比对分析后，设计筛选得到了1对具有高特异性的用于鉴别猪源性成分的RPA 引物。所述RPA引物不仅具有高度种内保守、种间特异的特点，且扩增片段长度较小，适用于高度加工的肉制品中猪源性成分的检测鉴别。

本发明通过在扩增靶标区间进行设计和筛选，得到了一条针对所扩增的靶标基因的高特异性crRNA探针，其对猪线粒体DNA片段具有高度特异性。