[发明专利]一种基于核酸质谱技术的DNA甲基化水平的检测方法

说明书

本发明公开了一种基于核酸质谱技术的DNA甲基化水平的检测方法，包括以下步骤：步骤一，试验准备；步骤二，PCR反应；步骤三，SAP反应；步骤四，转录；步骤五，树脂纯化；步骤六，定量检测；所述步骤二中，向PCR引物中加入适量的缓冲液或超纯水，稀释单管PCR引物至浓度100μM，本发明相较于现有DNA甲基化水平的检测方法，设计了一种新型的DNA重亚硫酸盐转化方法，该方法无需添加DNA保护剂，转化速度快，该方法采用纯化柱对转化的DNA进行纯化，能够得到高转化率、高质量及高纯度的DNA模板，本发明采用核酸质谱技术检测DNA甲基化水平，该检测方法不仅操作简便、准确率高，而且成本较低，适用于癌症早期评估和大规模筛查。

技术领域

本发明涉及基因检测技术领域，具体为一种基于核酸质谱技术的DNA甲基化水平的检测方法。

背景技术

DNA甲基化是指在DNA甲基化转移酶的作用下，在基因组CpG二核苷酸的胞嘧啶5号碳位共价键结合一个甲基基团，DNA甲基化能引起染色质结构、DNA构象、DNA稳定性及DNA与蛋白质相互作用方式的改变，从而控制基因表达；现有的技术中，使用商品化的亚硫酸盐转化试剂盒来实现DNA的快速转化，虽然缩短了转化的时间，但是提高了DNA片段化和降解水平，导致长片段的甲基化位点检测率下降；现有的DNA甲基化检测方法主要是采用TaqMan-PCR及其二代平台测序，该方法检测容量小、耗时长，而且操作过程较为繁琐，因此并不能很好的满足实际的检测需求。

发明内容

本发明的目的在于提供一种基于核酸质谱技术的DNA甲基化水平的检测方法，以解决上述背景技术中提出的问题。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种基于核酸质谱技术的DNA甲基化水平的检测方法，包括以下步骤：步骤一，试验准备；步骤二，PCR反应；步骤三，SAP反应；步骤四，转录；步骤五，树脂纯化；步骤六，定量检测；

其中在上述步骤一中，准备PCR扩增引物、SAP混合液、T转录/RNaseA混合液、超纯水、离心管、DNA模板、384孔板、离心机、混匀仪、QuanSNP核酸质谱系统和PCR仪备用；

其中在上述步骤二中，首先将每对PCR引物的上游引物和下游引物等摩尔混合，得到PCR引物混合液，再使用超纯水补水定容至PCR引物混合液中每条引物浓度为1μM，最后在每个PCR反应管中分装PCR引物混合液4μL，加入DNA模板1μL，1000rpm离心1min，混匀后置于PCR仪中进行PCR反应，得样品A待用；

其中在上述步骤三中，向步骤二中所制备的样品A中加SAP混合液2μL，1000rpm离心1min，然后进行SAP反应，待SAP反应结束后，得到样品B待用；

其中在上述步骤四中，首先向384孔板的每个孔中分别加入4μL的T转录/RNaseA混合液，然后向每个孔中转移2μL步骤三中所制备的样品B，用平板密封膜将384孔板封好，再将384孔板以500×g离心1min，最后将384孔板放入PCR扩增仪中，于35℃反应3h，得到样品C；

其中在上述步骤五中，首先向步骤四中所制备的样品C中加入20μL超纯水和干燥后的洁净树脂6mg，然后使用掌式离心机瞬时离心，避免树脂附着在管壁上，再将带有树脂的样品板放置在翻转混匀仪中，于20rpm混匀30min，混匀结束后，于2000rpm离心1min，最后取上清液；

其中在上述步骤六中，在靶板上滴加0.5μL步骤五中所得到的上清液，干燥结晶后，由QuanSNP核酸质谱系统测定甲基化水平。