[发明专利]一种基于核酸质谱技术的DNA甲基化水平的检测方法

权利要求书

1.一种基于核酸质谱技术的DNA甲基化水平的检测方法，包括以下步骤：步骤一，试验准备；步骤二，PCR反应；步骤三，SAP反应；步骤四，转录；步骤五，树脂纯化；步骤六，定量检测；其特征在于：

其中在上述步骤一中，准备PCR扩增引物、SAP混合液、T转录/RNaseA混合液、超纯水、离心管、DNA模板、384孔板、离心机、混匀仪、QuanSNP核酸质谱系统和PCR仪备用；

其中在上述步骤二中，首先将每对PCR引物的上游引物和下游引物等摩尔混合，得到PCR引物混合液，再使用超纯水补水定容至PCR引物混合液中每条引物浓度为1μM，最后在每个PCR反应管中分装PCR引物混合液4μL，加入DNA模板1μL，1000rpm离心1min，混匀后置于PCR仪中进行PCR反应，得样品A待用；

其中在上述步骤三中，向步骤二中所制备的样品A中加SAP混合液2μL，1000rpm离心1min，然后进行SAP反应，待SAP反应结束后，得到样品B待用；

其中在上述步骤四中，首先向384孔板的每个孔中分别加入4μL的T转录/RNaseA混合液，然后向每个孔中转移2μL步骤三中所制备的样品B，用平板密封膜将384孔板封好，再将384孔板以500×g离心1min，最后将384孔板放入PCR扩增仪中，于35℃反应3h，得到样品C；

其中在上述步骤五中，首先向步骤四中所制备的样品C中加入20μL超纯水和干燥后的洁净树脂6mg，然后使用掌式离心机瞬时离心，避免树脂附着在管壁上，再将带有树脂的样品板放置在翻转混匀仪中，于20rpm混匀30min，混匀结束后，于2000rpm离心1min，最后取上清液；

其中在上述步骤六中，在靶板上滴加0.5μL步骤五中所得到的上清液，干燥结晶后，由QuanSNP核酸质谱系统测定甲基化水平。

2.根据权利要求1所述的一种基于核酸质谱技术的DNA甲基化水平的检测方法，其特征在于：所述步骤一中，DNA模板是将1μg的样本DNA中加入至20μL体积的浓度为0.35mol/L的氢氧化钠溶液中，于42℃混匀瞬离10min后，然后加入160μL的亚硫酸氢盐溶液，在65℃反应1小时，冷却至20℃后，得到转化物，再取200μL的转化物，加入500μL的冰醋酸，涡旋振荡15s后瞬离，得到混合溶液，将混合液转移至DNA纯化柱中，回收DNA，然后向回收的DNA中加入一定体积的氢氧化钠溶液，使其在50μL的溶液中终浓度为0.3mol/L，于37℃反应15分钟，然后用醋酸氨将该溶液完全中和，最后在乙醇中沉淀，干燥得到DNA粉末，将得到的DNA粉末溶于超纯水中，得到DNA模板。

3.根据权利要求2所述的一种基于核酸质谱技术的DNA甲基化水平的检测方法，其特征在于：所述样本DNA是通过用商品化DNA提取试剂盒提取血样、组织、细胞和唾液等样品得到的。

4.根据权利要求2所述的一种基于核酸质谱技术的DNA甲基化水平的检测方法，其特征在于：所述DNA模板储存于-20℃条件下。

5.根据权利要求2所述的一种基于核酸质谱技术的DNA甲基化水平的检测方法，其特征在于：所述亚硫酸氢盐为重亚硫酸钠、亚硫酸氢钠、亚硫酸氨、亚硫酸氢铵或亚硫酸氢镁中的一种。

6.根据权利要求1所述的一种基于核酸质谱技术的DNA甲基化水平的检测方法，其特征在于：所述步骤二中，向PCR引物中加入适量的缓冲液或超纯水，稀释单管PCR引物至浓度100μM。

7.根据权利要求1所述的一种基于核酸质谱技术的DNA甲基化水平的检测方法，其特征在于：所述步骤三中，SAP混合液由SAP酶、SAPbuffer和去离子水混合制成。