[发明专利]一种无乳链球菌表面免疫原性重组蛋白及其制备方法与应用

权利要求书

1.一种无乳链球菌表面免疫原性重组蛋白，其特征在于：所述重组蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

2.根据权利要求1所述的无乳链球菌表面免疫原性重组蛋白的编码基因，其特征在于：所述编码基因的序列如SEQ ID NO:1所示。

3.一种包含权利要求2所述编码基因的表达载体。

4.由权利要求3所述的表达载体转化的宿主细胞。

5.如权利要求1所述的无乳链球菌表面免疫原性重组蛋白的制备方法，其特征在于：

将权利要求1所述的重组蛋白的编码基因构建到表达载体上，获得重组表达载体；将重组表达载体转化宿主细胞，培养转化的宿主细胞，使转化的宿主细胞表达产生所述无乳链球菌表面免疫原性重组蛋白，之后回收并纯化所表达的无乳链球菌表面免疫原性重组蛋白；

所述编码基因是以罗非鱼链球菌SIP蛋白基因序列为模板、SEQ ID No:3和SEQ ID No:4为引物进行PCR扩增得到的。

6.如权利要求1所述的无乳链球菌表面免疫原性重组蛋白在制备罗非鱼抗无乳链球菌感染的疫苗中的应用。

7.一种罗非鱼口服纳米疫苗，其特征在于：它是以权利要求1所述的无乳链球菌表面免疫原性重组蛋白作为抗原。

8.如权利要求7所述的罗非鱼口服纳米疫苗的制备方法，其特征在于：它包括以下步骤：

(1)制备MSN纳米颗粒；

(2)制备SIP-MSN纳米颗粒：将步骤(1)所得的MSN纳米颗粒与权利要求1所述的无乳链球菌表面免疫原性重组蛋白的溶液混合均匀后，置于多用途旋转摇床上，并在4-8℃混合10-12h，之后离心，回收沉淀，沉淀经冷冻干燥后即得所述SIP-MSN纳米颗粒；

(3)制备罗非鱼口服纳米疫苗：在SIP-MSN纳米颗粒表面包上羟丙基甲基纤维素邻苯二甲酸酯肠溶包衣，得SIP-MSN@HP55纳米颗粒，即所述罗非鱼口服纳米疫苗。

9.根据权利要求8所述的罗非鱼口服纳米疫苗的制备方法，其特征在于：步骤(2)的具体操作方法为：将步骤(1)所得的MSN纳米颗粒重悬在水中，形成MSN纳米颗粒悬浊液；接着在权利要求1所述的无乳链球菌表面免疫原性重组蛋白的溶液中加入一定体积的MSN纳米颗粒悬浊液，使得加入的MSN纳米颗粒达到1mg，混合均匀后，再放在多用途旋转摇床上，并在控温为4-8℃的冷室混合10-12h；之后离心，回收沉淀，沉淀经冷冻干燥后即得所述SIP-MSN纳米颗粒，并检测离心所得的上清蛋白浓度，计算蛋白的负载量和负载率。

10.根据权利要求8所述的罗非鱼口服纳米疫苗的制备方法，其特征在于：步骤(3)的具体操作方法为：将步骤(2)所得的SIP-MSN纳米颗粒重悬在水中，得SIP-MSN纳米颗粒悬浊液；接着在SIP-MSN纳米颗粒悬浊液中，加入PEG400作为蛋白保护剂后，再加入司班80作为乳化剂，加入二氯甲烷、乙酸乙酯，混匀；接着，在细胞破碎仪中超声乳化后，迅速倒入0.1％PVA中，超声清洗仪超声3min乳化后，再迅速转移倒入另一0.1％PVA中，将烧杯放在磁力搅拌机匀速搅拌，在溶液中滴加0.5％HP55，搅拌至有机溶剂挥发；离心收集沉淀，产物用去离子水洗2遍。