[发明专利]一种嵌合酶及其在体外一步反应合成Cap0 mRNA的用途和方法

说明书

本发明涉及分子生物学领域，特别是一种嵌合酶及其在体外转录中一步合成Cap0mRNA的用途和方法，所述方法包括利用嵌合酶和体外转录模板混合后共反应，一步反应获得加帽加尾的mRNA产物，所述嵌合酶包括RNA聚合酶结构域和加帽酶催化结构域，所述嵌合酶经嵌合设计具备体外转录和加帽的双重功能。本发明开辟了体外酶法一步合成mRNA的方法，提高了合成效率和mRNA产率。

技术领域

本发明涉及分子生物学领域，特别是涉及一种嵌合酶及其在体外一步反应合成Cap0 mRNA的用途和方法。

背景技术

近年来，以呼吸道为主的传染病严重威胁公众健康，在此背景下，基于mRNA的体外转录技术由于在研发设计中仅需提供抗原的基因序列，而不必进行高致病性病原的分离培养，在应对高传播风险的病毒时优势明显，且mRNA疫苗生产工艺简单、合成快速、成本较低，提供天然抗原表位，所以成为一种极具优势的新型疫苗。

mRNA的体外转录体系的工作原理是以DNA为模板，在一系列转录因子的作用下，经过RNA聚合酶合成RNA。转录反应中合成的加帽RNA可以用于体外翻译、转染等试验。常用的聚合酶为噬菌体来源的RNA聚合酶，如T7、SP6、T3等，其中T7 RNA聚合酶(T7 RNAPolymerase)是一种高度特异识别T7启动子序列的DNA依赖的5'→3'RNA聚合酶。T7 RNA聚合酶可以催化单链或双链DNA T7启动子下游NTP的掺入，合成与T7启动子下游的模板DNA互补的RNA。由于转录得到的RNA是不稳定的，因此需要对RNA进行加工修饰，包括5’端形成帽子结构，3’端添加poly(A)尾巴结构，起到稳定RNA、防止降解、帮助翻译等作用。体外mRNA加帽有两种常用方法，第一种是在mRNA转录系统中添加一个规则的m7GpppG帽类似物结构或者抗反向帽类似物(ARCA)来实现mRNA加帽及体外转录。第二种是在体外转录初期，通过加帽酶反应完成mRNA加帽，牛痘病毒加帽酶是催化形成帽子结构的有效酶，其由D1和D12两个亚基组成，兼具RNA三磷酸酯酶活性、鸟苷酰基转移酶活性和鸟嘌呤甲基转移酶活性，可将7-甲基鸟嘌呤帽结构(m7Gppp)连接到RNA的5'末端(m7Gppp5'N)。

目前，市场上的体外转录试剂盒主要是针对以上两种方法开发的，第一种依靠帽类似物在转录过程中产生帽子结构的方法，效率不高，产率较低，产生的转录产物的免疫原性较高，对后续转录产物mRNA的应用造成困难。第二种利用加帽酶对RNA的5’端添加帽子结构，此类产品也是在获得体外转录的RNA基础上，对产物进行加帽，这样的方法从转录、加帽到加尾涉及多次加酶操作，耗时较长，程序繁琐，流转的过程也会造成中间产物的降解和损失，整体的效率和产率都有待提升。

针对上述市场产品存在的技术问题，尤其是针对转录加帽如何同步工作，同时能够产生高质量转录产物的问题，许多专业人员都进行了相关改造和探索，比如在利用原核系统中的相关转录工具酶制备mRNA，选择将原核细胞裂解以后获得其中的RNA聚合酶和加帽酶，但是该法的裂解产物为原核细胞中的所有酶类，其中不乏大肠内源其他杂质核酸酶或核酸，这样会导致酶系统的特异性不高，降低后续的mRNA的生成效率、质量和产量。甚至会直接将RNA降解，无法有效转录目的片段。

所以目前缺乏工艺简便、流程较短的规模化量产的mRNA生产技术，建立这样一套操作简便、稳定性好、高效的mRNA制备方法将推动mRNA疫苗平台，助力未来的疫苗研发进程。

发明内容

鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种嵌合酶及体外一步反应合成Cap0 mRNA的方法，用于解决现有技术中的问题。