[发明专利]一种嵌合酶及其在体外一步反应合成Cap0 mRNA的用途和方法

权利要求书

1.一种用于体外酶法一步合成mRNA的嵌合酶，所述嵌合酶为转录加帽嵌合酶，其特征在于，所述嵌合酶包含加帽酶结构域和RNA聚合酶结构域，所述RNA聚合酶结构域包括RNA聚合酶和Spy Catcher，所述加帽酶催化结构域包括病毒加帽酶和Spy Tag；或，所述RNA聚合酶结构域包括RNA聚合酶和Spy Tag，所述加帽酶催化结构域包括病毒加帽酶和SpyCatcher；所述嵌合酶中Spy Tag和Spy Catcher共价结合；所述RNA聚合酶结构域和加帽酶催化结构域中均还包括蛋白纯化标签。

2.权利要求1所述的嵌合酶在体外转录中一步合成mRNA的应用。

3.一种体外转录一步合成mRNA的方法，其特征在于，包括以下步骤：①获得mRNA转录的模板DNA；②加入权利要求1所述的嵌合酶共反应进行体外转录一步获得具有Cap0帽子结构的mRNA。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，还包括以下特征中的任一项或多项：

1)所述模板DNA选自质粒DNA或分离的目的DNA片段；

2)所述方法还包括将缓冲液加入到嵌合酶与模板DNA的共反应体系中；

3)所述方法还包括将dNTP加入到嵌合酶与模板DNA的共反应体系中；

4)所述方法还包括将甲基化供体试剂加入到嵌合酶与模板DNA的共反应体系中；

5)共反应条件为35℃～38℃反应2-3小时；

6)所述方法还包括将共反应获得的具有Cap0帽子结构的mRNA进行纯化。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤1)中所述质粒DNA中包括目的DNA和载体，所述载体中包括T7启动子、5'和3'UTR以及PolyA尾元件。

6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述质粒DNA为可线性化的质粒DNA，所述可线性化的质粒DNA的载体的序列如SEQ ID NO:13所示。

7.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述嵌合酶中RNA聚合酶为噬菌体来源的RNA聚合酶、原核生物的RNA聚合酶、真核生物的RNA聚合酶或在线粒体及叶绿体中的RNA聚合酶；

和/或，

所述嵌合酶中病毒加帽酶选自以下中的一种或多种：牛痘病毒加帽酶、蓝舌病毒加帽酶、竹花叶病毒加帽酶、非洲猪瘟病毒加帽酶、1型有机湖藻DNA病毒加帽酶、2型有机湖藻DNA病毒加帽酶、球形综囊藻病毒加帽酶或金色藻病毒加帽酶。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述噬菌体来源的RNA聚合酶选自T7 RNA聚合酶、SP6 RNA聚合酶或T3 RNA聚合酶。

9.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述嵌合酶中RNA聚合酶通过第一连接肽和Spy Catcher连接，和/或，所述病毒加帽酶通过第二连接肽和Spy Tag连接。

10.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述嵌合酶为T7 RNA聚合酶-牛痘病毒加帽酶嵌合酶。

11.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述嵌合酶中RNA聚合酶结构域和加帽酶催化结构域中均还包括蛋白纯化标签；优选的，所述蛋白纯化标签选自HIS-Tag、GST-Tag、MBP-Tag、NusA-Tag或SUMO。

12.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述嵌合酶的氨基酸序列包括如SEQ IDNO:11和SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列。

13.一种多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸编码权利要求1所述的嵌合酶，或编码所述RNA聚合酶结构域，或编码所述加帽酶催化结构域。