[发明专利]一种短链羰基还原酶PpYSDR突变体、编码基因、重组表达载体、基因工程菌及应用

说明书

本发明涉及睾酮制备技术领域，公开了可用于不对称催化制备睾酮的短链羰基还原酶PpYSDR突变体，该突变体由短链羰基还原酶PpYSDR的氨基酸序列的第85位甲硫氨酸突变为谷氨酰胺、第88位亮氨酸突变为天冬酰胺、第136位亮氨酸突变为丙氨酸和第143位天冬氨酸突变为丙氨酸中的一种或几种后得到；短链羰基还原酶PpYSDR的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。上述突变得到的短链羰基还原酶PpYSDR的突变体具有很高的催化雄烯二酮转化成睾酮的活性，可以游离酶、固定化酶或重组游离细胞的形式催化合成睾酮，雄烯二酮的转化率高，睾酮的收率高，选择性高。

技术领域

本发明涉及睾酮制备技术领域，具体涉及一种可用于不对称催化制备睾酮的短链羰基还原酶PpYSDR的突变体、突变体的编码基因、重组表达载体、基因工程菌及其具体应用。

背景技术

睾酮是由男性的睾丸或女性的卵巢分泌的类固醇荷尔蒙，其分子式为C₁₉H₂₈O₂，是一种分子量较小的细胞骨架联合蛋白，通过与其他细胞骨架蛋白间的相互结合发生作用，具有维持肌肉强度及质量、维持骨质密度及强度、提神及提升体能等作用。目前睾酮的体外制备方法主要是化学合成方法，即使用雄烯二酮(4-AD)合成睾酮，通常采用如下两种合成路线：

路线一:雄烯二酮选择性醚化后，用硼氢化钠或硼氢化钾进行还原，后加酸水解；

路线二:雄烯二酮先用硼氢化钠或硼氢化钾进行还原生成睾丸素及双醇混合物，后用MnO₂进行选择性氧化生成睾酮。

但化学合成涉及金属催化剂使用等，存在成本高、污染大、能耗高、投料量小等问题。

采用生物合成方法合成睾酮是一种新的发展方向，目前生物合成方主要有两类：一是通过水解酶或脂肪酶对睾酮酯进行水解生成睾酮，如专利号CA2767052C的加拿大专利使用51032水解酶水解睾酮酯，可以做到产物浓度为25g/L；另一类则是通过固醇脱氢酶还原雄烯二酮合成睾酮的一步反应合成路线。如专利号ITMI20091168A1专利报道使用17位固醇脱氢酶与雄烯二酮反应生成睾酮底物浓度可以到10g/L。

但是生物合成法与化学合成法相比虽然更加绿色，但是产量小，且成本高。

发明内容

针对现有睾酮的生物合成方法存在投放量小、合成效率低的问题，本发明的目的在于提供一种短链羰基还原酶PpYSDR突变体，可用于生物合成睾酮，具有投放量大、合成效率高等优点。

本发明的另一目的为提供上述短链羰基还原酶PpYSDR突变体的编码基因。

本发明的另一目的为提供含有上述编码基因的重组表达载体。

本发明的另一目的为提供用于制备上述突变体的基因工程菌。

本发明的另一目的为提供上述突变体、编码基因、重组表达载体或基因工程菌在以雄烯二酮为底物不对称催化制备睾酮上的应用。

本发明提供如下的技术方案：

一种短链羰基还原酶PpYSDR突变体，所述突变体由短链羰基还原酶PpYSDR野生型的氨基酸序列第85位甲硫氨酸突变为谷氨酰胺、第88位亮氨酸突变为天冬酰胺、第136位亮氨酸突变为丙氨酸和第143位天冬氨酸突变为丙氨酸中的一种或几种后得到；

所述短链羰基还原酶PpYSDR的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

发明人研究发现，通过上述突变得到的短链羰基还原酶PpYSDR突变体具有很高的催化雄烯二酮转化成睾酮的活性，可以游离酶、固定化酶或重组游离细胞的形式催化合成睾酮，雄烯二酮的转化率高，睾酮的收率高，选择性高。其中对应的短链羰基还原酶PpYSDR野生型的氨基酸序列SEQ ID NO.2如下所示：