[发明专利]一种提高血液循环肿瘤细胞俘获的方法

说明书

本发明公开了一种提高血液循环肿瘤细胞俘获的方法，包括如下步骤：S1、将待检测血液通过膜芯片的过滤，将CTC留在膜上；S2、加入荧光标记的rVAR2/anti‑CD45荧光抗体/DAPI到膜上；S3、荧光显微镜CTC计数。本发明应用rVAR2荧光染色俘获后的CTC，俘获/识别CTC不依赖于CTC表面表达单一蛋白，尽可能的把上皮细胞来源的CTC和间质细胞性质的CTC一起俘获；这样提高了俘获的效率和准确性，而且俘获方法经济、简便。

技术领域

本发明涉及一种提高血液循环肿瘤细胞俘获的方法。

背景技术

CTC是指进入到血液循环中的肿瘤细胞。CTC检查是测定血液中流动癌细胞的一种检查。通过CTC检查能够识别出影像检查无法发现的超早期微小癌，临床上能够比以往传统的诊断方法更早的发现肿瘤，能得知超早期的原发癌发病率，以及超早期的癌症转移或复发。肺癌、直肠癌、乳腺癌、前列腺癌、胰腺癌等肿瘤患者CTC是血中观察肿瘤预后治疗效果的重要生物标记物。肿瘤病人血中CTC数目越多，病人的预后越差。

目前，CTC的俘获技术基于原理有两大类-物理方法和化学方法。化学方法比较代表的是美国FDA唯一批准的CTC俘获技术。技术核心原理是利用抗原-抗体的结合来俘获肿瘤细胞。基于抗原和抗体的化学方法有些缺点：a)抗原与抗体的结合容易致CTC的凋亡，使得俘获的CTC数目减少。这点已经被大量的研究证实；b)不能俘获EMT细胞-即从上皮到间质转化的细胞，这类细胞不表达传统的上皮细胞表面抗原标记物，所以不被抗体识别和俘获。这类细胞恶性度最大，是肿瘤转移的元凶。

物理方法是根据细胞的形态大小和密度的不同。根据形态大小的不同是主要的方法。这类方法简便，不易致CTC的凋亡，也能俘获EMT细胞。基于肿瘤细胞大小技术的CTC俘获后，需要对俘获的肿瘤细胞进行识别和计数，富集的肿瘤细胞用荧光抗体来鉴定。CTC被荧光确定为CK+、CD45-和DAPI+，这也是当前对CTC荧光诊断的金标准。但CK在生长过程中也呈现表达下调，甚至消失。同时，癌症干细胞也缺乏CK的表达。因此，捕获CTC时以CK检测将丢失某些特定的CTCs，使检测的细胞数目减少。

针对EMT细胞，荧光抗体鸡尾酒中可以用vimentin的荧光抗体。但多抗体的应该一方面增加检测的成本和检测的复杂性，另一方面又增加了非特异性结合的白细胞。同时，EMT细胞不是所有肿瘤患者血液中都会存在的。

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服现有技术中血液中CTC检测的数目不准确的缺陷，提供一种利用ofCS(癌胚硫酸软骨素)特异性的表达在几乎所有的肿瘤细胞的表面和VAR2特异性与ofCS结合的特点，用rVAR2来荧光俘获CTC,提高CTC检测的数目和灵敏度。

为了解决上述技术问题，本发明提供了如下的技术方案：

一种提高血液循环肿瘤细胞俘获的方法，包括如下步骤：

S1、将待检测血液通过膜芯片的过滤，将CTC留在膜上；

S2、加入荧光标记的rVAR2/anti-CD45荧光抗体/DAPI到膜上；

S3、荧光显微镜CTC计数。

进一步的，将rVAR2包裹在磁珠的表面做成rVAR2磁珠来俘获和富集血中的CTC，再用Pan-CK或者EpCAM荧光抗体来识别CTC。

重组VAR2蛋白(rVAR2)的荧光标记:市场上抗体及蛋白标记的荧光染料主要有CFTM系列、Alexa系列、DyLight系列、Cy系列、IR Dye系列等。使用最多的为Alexa系列和CFTM系列。根据激发光的不同又有蓝色、绿色、橙红色、红色、远红外、近红外等分类。荧光标记的rVAR2的作用相当于ofCS的荧光抗体，特异性的与ofCS相结合。它的荧光染料的选择要与CD45抗体的荧光染料和DAPI的荧光色素要区分开来。