[发明专利]一种透析液中神经递质的检测方法

说明书

本发明属于分析化学技术领域，提供了一种透析液中神经递质的检测方法。本发明以乙腈为流动相B、甲酸铵水溶液作为流动相A，正、负离子同时扫描的质谱检测模式，首次完成了4类共13个神经递质的同时定性和定量检测，分析时间短，定性和定量检测结果准确、可靠，无需将待测透析液分别采用不同的检测仪器或不同的流动相条件进行分析，节省了样本量、样本的检测时间，也为在线检测提供了必要的前提，具有可期的临床应用前景。本发明在进行超高效液相色谱‑质谱检测前，对待测透析液进行富集，实现了对低含量神经递质的透析液的检测。

技术领域

本发明涉及分析化学技术领域，具体涉及一种透析液中神经递质的检测方法。

背景技术

神经递质是指由突触前神经元合成并在末梢处释放，能特异性作用于突触后神经元或效应器细胞上的受体，并能起到信息传递作用的一类化学物质。神经递质主要包括γ-氨基丁酸、谷氨酸和甘氨酸等氨基酸类，5-羟色胺、肾上腺素和去甲肾上腺素等单胺类，乙酰胆碱和胆碱等胆碱类，腺苷及其衍生物单磷酸腺苷、二磷酸腺苷和三磷酸腺苷等嘌呤类及肽类等。

氨基酸类神经递质分为兴奋性(EAAs)和抑制性(IAAs)两大类，它们是调节机体生理活动的重要物质。其中，兴奋性氨基酸包括谷氨酸和天冬氨酸等，它们在维持神经元正常信号传递过程中起重要作用，而抑制性氨基酸包括γ-氨基丁酸和甘氨酸等，主要作为抑制性神经递质介导脊髓及脑干的快抑制性突触传递。单胺类神经递质包括儿茶酚胺类(多巴胺、去甲肾上腺素和肾上腺素)和吲哚类(5-羟色胺)，两类神经元存储于突触前膜囊泡内，在人体的神经、心血管等系统中有着重要的调节作用。胆碱类神经递质主要指乙酰胆碱，它是许多外周神经的神经递质，胆碱类的改变与神经系统的肌肉疾病、癫痫、脑外伤及脑炎等多种疾病有关。嘌呤类神经递质主要包括腺嘌呤、腺苷及其衍生物，嘌呤类在机体代谢内占有重要地位，可以保护神经系统，调制痛觉，并在脑血管、胃肠道活动、神经系统免疫反应、癌变和神经再生过程中起到重要作用。

肌肉外周神经系统内存在大量的神经递质，其含量的变化对生物体有着重要的影响，并与多种疾病密切相关，包括肌肉强直、类风湿性关节炎、骨关节炎等。有研究表明，靶向周围神经中的谷氨酸能信号是促进再生和修复以及疼痛控制的重要途径；5-羟色胺参与了肌肉收缩、血压调控、血小板聚集等众多生理调节过程；肌强直病人的肌组织中乙酰胆碱的含量增高(正常肌肉中含量很少)。因此，对组织匀浆液等生物样本进行含量测定，并监测肌肉组织内神经递质含量的变化，对于神经学研究具有重要的意义。但是，由于大部分递质在生物样品中含量低、基质复杂、内源性成分干扰大。因而，其含量的测定对于样品的前处理、仪器的灵敏度等均有着较高的要求。

目前，关于生物样品中神经递质的检测方法已经有了很多报道。其中，单胺类神经递质较为常用的有电化学、荧光法、毛细管电泳法及液质联用法(LC-MS/MS)；氨基酸类神经递质多采用柱前衍生化后的荧光法检测以及液质联用法；胆碱类主要采用电化学检测；腺苷类多采用毛细管电泳法和液质联用法检测。不同类型神经递质的检测大都采用高效液相系统进行分离，只是在检测器的选择上有所差异。对于样品中神经递质的检测所面临的问题，主要包括以下几个方面：1、神经递质的含量很低，且属于内源性物质，其他物质对其干扰较大；2、单胺类成分的化学性质不稳定，在光照和碱性条件下易发生氧化分解；3、氨基酸类递质采用HPLC-荧光法需要对检测样本进行衍生化以使其产生荧光，加大了分析检测及方法学建立上的难度。

相较于其他检测手段，LC-MS/MS法无需衍生化，操作简单、灵敏度高、分析时间短、选择性高，是分析复杂生物样本中痕量成分的有力工具，通过适当优化样品的前处理条件及色谱、质谱条件可以满足生物样本的分析要求。而在采用质谱方法进行测定时，单胺类、氨基酸类和胆碱大多采用正模式的质谱检测方法以得到更高的仪器响应，而嘌呤类中的单磷酸腺苷、二磷酸腺苷、三磷酸腺苷由于存在带负电的磷酸根基团，所以更合适采用碱性流动相条件下的负离子模式检测，虽然有文献报道采用离子对试剂(N,N-二甲基己胺、二丁胺乙酸等)作为流动相后能用正离子模式进行检测，但前期研究发现重复性较差。因此，需要找到更合适的色谱条件和质谱条件，使单磷酸腺苷类神经递质与其他类神经递质同时检测，达到减少检测成本和时间的目的。