[发明专利]高效同源重组的拟无枝酸菌工程菌株、其构建方法及应用

说明书

高效同源重组的拟无枝酸菌工程菌株、其构建方法及应用。本发明提供ku1和/或ku2基因缺失在提高拟无枝酸菌(Amycolatopsissp.)的同源重组效率中的应用，本发明还提供高效同源重组的拟无枝酸菌工程菌株，所述拟无枝酸菌工程菌株缺失了拟无枝酸菌的ku1基因和/或ku2基因，本发明还提供所述菌株的构建方法及应用。本发明通过实验验证了缺失ku1基因、ku2基因或同时缺失ku1基因和ku2基因均能显著提高拟无枝酸菌的同源重组效率。其中，ku1基因缺失的工程菌株的同源重组效率达到95％，具有最突出的效果。

【技术领域】

本发明属于基因工程技术领域。更具体地，本发明涉及一种高效同源重组高效的拟无枝酸菌工程菌株，还涉及所述工程菌株的构建方法及应用。

【背景技术】

香兰素又称香草醛(3-甲氧基-4-羟基苯甲醛)，是世界上使用最广泛的调味料之一，在食品、药品、化妆品、农业等领域被广泛应用。香兰素可由天然底物阿魏酸生物转化而来，拟无枝酸菌属被报道能够利用阿魏酸生产香兰素，具有非常好的产业化应用价值。但是由于同源同组效率低，使得基因打靶等遗传操作难度大，限制了香兰素合成中的代谢工程改造，这可能与拟无枝酸菌的GC含量高、质粒转化后非同源DNA整合频率高等有关。因此，开发一种遗传操作高效的拟无枝酸菌底盘细胞及其方法具有重要的应用价值。

基因打靶技术是现代分子生物学的一个重要研究手段，通常是指利用同源重组的方法将含已知序列的外源DNA片段与生物体基因组发生结合，整合至受体染色体特异性靶位点上。该技术可增加外源DNA片段，或者删除同源臂之间DNA片段，可以用于基因敲除、基因替换和外源基因定点过表达等多种遗传改造。因此，基因打靶技术在代谢工程改造研究中发挥着非常重要的作用。在拟无枝酸菌中DNA双链断裂修复主要依靠非同源末端连接途径(Non-homologous End Joining，NHEJ)，导致外源DNA主要以随机插入方式整合至基因组染色体上，同源重组效率低下，严重制约了基因打靶技术在拟无枝酸菌中的应用。因此一种高效的基因打靶技术将为拟无枝酸菌菌株基因工程改造提供重要技术支持。

【发明内容】

本发明的目的是通过基因改造提供一种高效同源重组的拟无枝酸菌工程菌株，还提供所述工程菌株的构建方法及应用。

本发明的思路是研究ku1基因或ku2基因与拟无枝酸菌在同源重组实验的有效率关系，确认ku1基因或ku2基因的敲除在提高拟无枝酸菌的同源重组效率的意义。

基于此，本发明提供ku1基因缺失在提高拟无枝酸菌(Amycolatopsis sp.)的同源重组效率中的应用。在本发明中，所述ku1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

另一方面，本发明还提供ku2基因缺失在提高拟无枝酸菌(Amycolatopsis sp.)的同源重组效率中的应用。所述ku2基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。

本发明还提供高效同源重组的拟无枝酸菌(Amycolatopsis sp.)工程菌株，所述拟无枝酸菌工程菌株缺失了拟无枝酸菌(Amycolatopsis sp.)的ku1基因和/或ku2基因。

在本发明中，所述ku1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，所述ku2基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。

进一步地，本发明还包括上述拟无枝酸菌(Amycolatopsis sp.)工程菌株的构建方法，所述方法包括以下步骤：

(1)

分别用ku1-U-FOR/ku1-U-REV与ku1-D-FOR/ku1-D-REV和/或ku2-U-FOR与ku2-U-REV为引物，以拟无枝酸菌(Amycolatopsis sp.)基因组为模板，PCR扩增ku1基因或ku2基因的上下游同源臂；

(2)