[发明专利]高效同源重组的拟无枝酸菌工程菌株、其构建方法及应用

权利要求书

1.ku1基因缺失在提高拟无枝酸菌(Amycolatopsis sp.) 的同源重组效率中的应用，所述ku1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

2.ku2基因缺失在提高拟无枝酸菌(Amycolatopsis sp.) 的同源重组效率中的应用，所述ku2基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。

3.高效同源重组的拟无枝酸菌(Amycolatopsis sp.)工程菌株，所述拟无枝酸菌工程菌株缺失了拟无枝酸菌(Amycolatopsis sp.)的ku1基因和/或ku2基因，所述ku1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，所述ku2基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。

4.权利要求3所述的拟无枝酸菌(Amycolatopsis sp.)工程菌株的构建方法，所述方法包括以下步骤：

（1）

分别用ku1-U-FOR/ku1-U-REV与ku1-D-FOR/ku1-D-REV和/或ku2-U-FOR/ku2-U-REV与ku2-D-FOR/ku2-D-REV为引物，以拟无枝酸菌(Amycolatopsis sp.)基因组为模板，PCR扩增ku1基因和/或ku2基因的上下游同源臂；其中，引物序列为：

ku1-U-FOR ggccagtgccaagcttaggcagagccggtagctcca

ku1-U-REV ctgacacccccttccacatcgatcgcat

ku1-D-FOR ggaagggggtgtcagacatggagtgcc

ku1-D-REV acatgattacgaattcgtcccgctgctgatcgtcgt

ku2-U-FOR ggccagtgccaagcttacgacgaactgcggttccag

ku2-U-REV tttgcgcgctccagatcgctcgcgccat

ku2-D-FOR tctggagcgcgcaaacgcgcttcctga

ku2-D-REV acatgattacgaattctcctgcaggccaccgccaaa

（2）

所得上下游同源臂片段通过Assembly试剂盒连接到pKC1139质粒的HindIII/EcoRI位点，构建得到质粒pKC1139-ku1和/或pKC1139-ku2；

（3）

利用接合转移实验方法，将pKC1139-ku1和/或pKC1139-ku2质粒转化到拟无枝酸菌(Amycolatopsis sp.)中，经阿伯拉霉素抗性筛选出阳性突变株，获得敲除ku1和/或ku2基因的拟无枝酸菌(Amycolatopsis sp.)工程菌株，所得工程菌株经PCR验证正确。

5.根据权利要求4所述的构建方法，其特征在于步骤（3）中，所述拟无枝酸菌(Amycolatopsis sp.)是拟无枝酸菌（Amycolatopsis sp.）HM-141，该菌株已于2021年7月9日在北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，其保藏编号为CGMCC No. 22871。