[发明专利]一种发酵生产白喉毒素CRM197蛋白的菌种培养基、配制方法以及菌种复苏培养方法

说明书

本申请涉及生物工程领域，更具体地说，它涉及一种发酵生产白喉毒素无毒形式CRM197蛋白的菌种培养基、配制方法以及菌种复苏培养方法；一种发酵生产白喉毒素无毒形式CRM197蛋白的菌种培养基，由溶液A、溶液B、溶液C和溶液D制成；菌种培养基的配制方法为：S1、配制溶液；S1.1、配制溶液A；S1.2、配制溶液B；S1.3、配制溶液C；S1.4、配制溶液D；S2、溶液混合。菌种复苏培养方法，包括以下步骤：步骤一、复溶菌种；步骤二、一代固体培养；步骤三、二代固体培养；步骤四、菌液收集。本申请可构建具有较高活性的CRM197主种子库或工作种子库。

技术领域

本申请涉及生物工程领域，更具体地说，它涉及一种发酵生产白喉毒素CRM197蛋白的菌种培养基、配制方法以及菌种复苏培养方法。

背景技术

CRM197为白喉毒素的无毒形式，但其在免疫上与白喉毒素没有区别。CRM197由不产毒噬菌体β197tox感染的白喉棒杆菌产生，而β197tox是通过对产毒棒状噬菌体进行亚硝基胍诱突创造的(Uchida等Nature New Biology(1971)233；8-11)。CRM197蛋白具有与白喉毒素相同的分子量，但其结构基因不同，其中有单碱基变化。这导致52位的氨基酸从甘氨酸变为谷胺酰胺，使A片段不能结合NAD，因此无毒(Pappenheimer 1977，AnnRev，Biochem.46；69-94，RappuoliApplied and Environmental Microbiology Sept 1983p560-564)。由于没有毒性的 CRM197蛋白仍然可与敏感细胞的受体结合，即CRM197蛋白在丧失酶活性及毒性的同时仍保留白喉毒素的免疫原性，因此是一种理想的多糖结合疫苗载体蛋白。

然而，无论是天然的CRM197菌种还是重组构建的CRM197工程菌，在实际的菌种发酵过程中，培养基和培养方式是制约其高量产的重要一环。因此，研发出一种恰当的培养基和培养方式，构建具有较高活性的CRM197主种子库或工作种子库是亟需所要解决的问题。

发明内容

为了获得高表达量的发酵菌液，构建具有较高活性的CRM197主种子库或工作种子库，本申请提供一种发酵生产白喉毒素CRM197蛋白的菌种培养基、配制方法以及菌种复苏培养方法。

第一方面，本申请提供一种发酵生产白喉毒素CRM197蛋白的菌种培养基，采用如下的技术方案：

一种发酵生产白喉毒素CRM197蛋白的菌种培养基，由包括体积比为(1000)：(2-6)：(1-5)：(24-42)的溶液A、溶液B、溶液C和溶液D制成；

每1000mL所述溶液A由包括以下原料制成：酵母提取物20-32g、酪蛋白氨基酸7-13g、L- 色氨酸47-58mg、磷酸二氢钾3-8g、氯化钙1-2g；

每100mL所述溶液B由包括以下原料制成：七水硫酸镁20-24g、β-丙氨酸110-130mg、烟酸107-120mg、庚二酸6.5-10.5mg、五水硫酸铜0.3-1g、五水硫酸锌0.1-0.6g、四水硫酸锰 55-90mg、盐酸2-4mL；

每100mL所述溶液C由包括以下原料制成：L-胱氨酸15-23g、盐酸11-24ml；

每100mL所述溶液D由包括以下原料制成：麦芽糖30-55g、氯化钙0.5-2g。

通过采用上述技术方案，首先，本申请菌种培养基的配方中，除酵母提取物和酪蛋白氨基酸外，其余均为国产试剂，大大降低生产成本。

其次，通过本申请菌种培养基的配方，使CRM197菌种得以大规模扩增而获得高表达量的发酵菌液，从而构建具有较高活性的CRM197主种子库或工作种子库。

优选的，培养基由包括体积比为(1000)：(2)：(1)：(30)的溶液A、溶液B、溶液 C和溶液D制成。

优选的，每1000mL所述溶液A由包括以下原料制成：酵母提取物20g、酪蛋白氨基酸10g、L-色氨酸50mg、磷酸二氢钾5g、氯化钙1g；