[发明专利]一种竹子根内生菌的分离鉴定方法

说明书

本发明公开了一种竹子根内生菌的分离鉴定方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：采集无病虫害的健康且生长良好的毛竹根部作为样品，剪取新鲜健康竹根若干，剪取后立即将所得竹根置于密封袋中保存；将上述剪取的竹根进行消毒，然后转移到无菌研钵中充分研钵，然后取上清液稀释，将稀释后的上清液200μL分别倒入LB和PDA培养基中培养，将LB培养基至于37℃恒温培养，PDA培养基至于28℃恒温培养；挑取长势较好菌落用接种灭菌环进行划线培养，从形态特征明显的，典型的单菌落中挑取少量菌体至LB和PDA培养基中，经培养后即为初步分离的毛竹内生菌纯种；对分离得到的毛竹内生菌进行鉴定。本发明的分离鉴定方法简单，易操作。

技术领域

本发明属于微生物学技术领域，具体而言，涉及一种竹子根内生菌的分离鉴定方法。

背景技术

植物内生菌是一个庞大的微生物类群，指那些在其生活史的某一阶段生活在健康植物的各种组织内，是植物微生态系统的重要组成部分。植物内生菌的种类繁多，主要包括内生细菌、内生真菌和内生放线菌三大类，其中放线菌的数量和种类一般较少。现已分离到的植物内生细菌有革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌，超过129种，分属于54个属。主要为伯克氏菌属、假单胞菌属、肠杆菌属、芽孢杆菌属等。植物内生真菌都属于子囊菌类，主要包括核菌纲、盘菌纲和腔菌纲等。是一类与宿主植物建立了和谐的关系并且使宿主植物不表现感染症状的微生物。

内生菌既可以通过产生对植物生长有促进作用的植物激素、蛋白酶等物质直接影响竹子的生理代谢，还可以通过生物固氮、溶磷等方式增强宿主植物吸收营养物质的能力间接促进植物生长。

现有技术中也有公开关于植物内生菌的分离方法。例如，申请号为：CN200810107514.1的中国发明专利公开了一种分离获得植物内生菌的方法，是经过植物预处理、表面消毒、内生菌的浸出、内生菌的分离纯化等步骤，利用机械研磨和剪切力使植物内生菌浸出，同时加入表面活性剂和纤维素酶分解植物纤维及植物细胞壁，使植物组织中的内生菌分离出来。又如，申请号为CN201510410155.7的中国发明专利公开了一种牡丹营养器官内生细菌的分离纯化方法、培养基及其制备方法，本发明的关键在于分离纯化培养基的配制。

有研究表明竹子中有对自身有促生长等作用的内生菌，但目前尚未公开有对竹子根内生菌的分离鉴定方法。

发明内容

针对上述问题，本发明提供了一种竹子根内生菌的分离鉴定方法。本发明的分离鉴定方法效果明显，能够有效分离出对植物有促生长作用的内生菌菌株。

本发明的目的及解决其技术问题是采用以下技术方案来实现的。

本发明提供了一种竹子根内生菌的分离鉴定方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：

采集无病虫害的健康且生长良好的毛竹根部作为样品，剪取新鲜健康竹根若干，剪取后立即将所得竹根置于密封袋中保存；

将上述剪取的竹根进行消毒，然后转移到无菌研钵中充分研钵，然后取上清液稀释，将稀释后的上清液200μL分别倒入LB和PDA培养基中培养，将LB培养基至于37℃恒温培养，PDA培养基至于28℃恒温培养；

挑取长势较好菌落用接种灭菌环进行划线培养，从形态特征明显的，典型的单菌落中挑取少量菌体至LB和PDA培养基中，经培养后即为初步分离的毛竹内生菌纯种；

对分离得到的毛竹内生菌进行鉴定。

优选地，所述消毒过程为：用自来水对植株表面洗涤4-5次，用经过消毒的纸巾充分吸干水分，首先使用75％乙醇溶液漂洗1min，后用无菌水反复冲洗，再用经过消毒的纸巾充分吸干水分，使用1％次氯酸钠溶液漂洗4min，再次用无菌水冲洗掉次氯酸钠溶液后置于转移至75％乙醇溶液中浸泡30s，最后用无菌水将乙醇溶液冲洗干净，并用无菌试纸将竹根的水分吸干。