[发明专利]一种从人诱导多能干细胞分化为自然杀伤细胞的方法

说明书

本发明属于生物技术领域，涉及一种从人诱导多能干细胞分化为自然杀伤细胞的方法，包含如下步骤，步骤一：采用人诱导多能干细胞分化形成具有KDR+CD73+表达的内皮祖细胞；步骤二:所述具有KDR+CD73+表达的内皮祖细胞经内皮‑血液转化，形成具有CD34‑CD45+表达的NK祖细胞；步骤三：NK祖细胞进一步分化为具有CD56+CD3‑表达的NK细胞。本发明提供的方案所产生NK细胞高表达NKG2D受体，具有更强的细胞因子分泌能力和肿瘤杀伤能力。

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及人诱导多能干细胞(iPSC)向免疫细胞分化的关键技术，尤其是一种从人诱导多能干细胞分化为自然杀伤细胞的方法。

背景技术

人类自然杀伤细胞(NK)是人体固有免疫系统的重要组成部分，是人体对抗感染和杀伤肿瘤细胞的第一道防线。NK细胞可通过其细胞表面的细胞毒性受体(NKp46、NKp44、NKp30)、NKG2D和DNAM-1(CD226)等识别肿瘤抗原，并通过自然杀伤(通过穿孔素、颗粒酶裂解肿瘤细胞)、分泌细胞因子，以及抗体依赖的ADCC途径杀伤和抑制肿瘤细胞。

NK细胞对于机体防御和对抗肿瘤非常关键，但肿瘤病人体内的NK通常是功能受损的，因此，通过外源输入功能正常或经过基因改造的功能加强的NK细胞对肿瘤细胞进行杀伤，即NK细胞过继治疗，是目前癌症治疗的前沿和热点。NK细胞过继治疗需要解决的瓶颈之一即NK细胞的来源问题。虽然NK细胞可以从病人自身或健康供者的血液中提取，但存在着个体差异大，扩增倍数有限，细胞质量难以控制，基因改造难度大等问题。

诱导多能干细胞(iPSC)是日本科学家山中伸弥2006年利用病毒载体将四个转录因子(Oct4,Sox2,Klf4和c-Myc)的组合转入分化的体细胞中，使其重编程而得到的类似胚胎干细胞的一种细胞类型，具有在体外无限增殖并分化为多种类型的人体功能细胞的能力。iPSC制备技术的建立，为解决免疫细胞治疗中种子细胞来源受限，供者间配型成功率低，细胞体外扩增能力有限等诸多技术瓶颈带来了创新性的解决途径。

现有技术中也有如采用在无血清培养基中培养多能干细胞，聚集未分化干细胞以形成胚状体，其被培养以产生造血前体细胞，并将前体细胞培养以产生NK细胞。但其存在的技术问题是：1)使用了Spin EB的方法形成拟胚体，操作复杂且难以扩大规模；2)过程中使用了动物源性成分(Matrigel、Gelatin等)；3)使用了feeder细胞(OP9、K562)。

术语释义：

发明内容

本申请提供一种从人诱导多能干细胞分化自然杀伤细胞的方法，所产生NK细胞高表达NKG2D受体，具有更强的细胞因子分泌能力和肿瘤杀伤能力。

为实现上述技术目的，本申请采取的技术方案为一种从人诱导多能干细胞分化自然杀伤细胞的方法，包含如下步骤：

步骤一：采用人诱导多能干细胞分化形成具有KDR+CD73+表达的内皮祖细胞；

步骤二：所述具有KDR+CD73+表达的内皮祖细胞经内皮-血液转化，形成具有CD34-CD45+表达的NK祖细胞；

步骤三：所述具有CD34-CD45+表达的NK祖细胞进一步分化为具有CD56+CD3-表达的NK细胞。

在一些实施方案中，所述步骤一中分化所依赖的培养体系为在生物反应器或细胞工厂中接种人诱导多能干细胞。

在一些实施方案中，所述步骤一分化依赖于培养基Ⅰ，所述培养基Ⅰ成份含有细胞因子I；所述细胞因子Ⅰ包括细胞因子组合A与细胞因子组合B；

所述细胞因子组合A为VEGF，bFGF，Activin-A中的至少两种的组合；

所述细胞因子组合B为BMP-4，SCF，IL-3，IL-6，TPO，FLT3L中的至少一种或多种的组合；