[发明专利]靶向小鼠CD274基因的gRNA及构建EAE疾病小鼠模型的方法

说明书

本发明属分子生物学领域，具体公开了一组靶向小鼠CD274基因的gRNA及构建EAE疾病小鼠模型的方法；本发明设计了特异性靶向CD274基因的gRNA，利用Cas9将CD274基因的第3个外显子敲除，造成移码突变，从而达到将该基因敲除的目的。该方法简单易行，周期短，在小鼠受精卵内就可实施，获得阳性克隆的几率很高。由该方法获得的CD274基因敲除小鼠是作为研究EAE疾病的最佳模型，利用该小鼠模型可以充分研究该疾病的致病机理，并进一步开发针对该疾病的治疗方式。

技术领域

本发明属分子生物学领域，具体公开了一组靶向小鼠CD274基因的gRNA及构建EAE疾病小鼠模型的方法。

背景技术

脊髓炎是指由病毒、细菌、螺旋体、立克次体、寄生虫、原虫、支原体等生物原性感染，或由感染所致的脊髓灰质或(和)白质的炎性病变，以病变水平以下肢体瘫痪、感觉障碍和植物神经功能障碍为其临床特征。临床上虽有急性、亚急性和慢性等不同的表现形式，但在病理学上均有病变部位神经细胞变性，坏死、缺失；白质中髓鞘脱失、炎性细胞浸润、胶质细胞增生等改变。因此，脊髓炎包括了大量的脊髓炎性疾病。实验性变态反应性脑脊髓炎(EAE)是一种以特异性致敏的CD4+T细胞介导为主的，以中枢神经系统内小血管周围出现单个核细胞浸润及髓鞘脱失为特征的自身免疫性疾病。实验动物疾病模型对于研究人类疾病发生的病因、发病机制、开发防治技术和开发药物是不可缺少的研究工具。国内外学者试用多种易感动物建立EAE模型，以阐明EAE的发病机制，并为其病情的监测、复发的预防、治疗方案的选择以及新疗法或新药物的筛选等提供可靠依据，在临床神经免疫学的研究中具有重要意义。

从鸟类到哺乳类的多种动物如鸡、小鼠、大鼠、豚鼠、家兔、羊、犬、猴等均可成功诱发EAE，但不同种属或同一种属不同品系动物的敏感性有很大差异。豚鼠对诱发EAE相当敏感，但其品系复杂，有关试剂缺乏，一般不常用作实验对象。相比之下大鼠及小鼠的背景知识及相关试剂则较为全面，遗传学、免疫学等方面的研究也较深入，且其EAE在临床、病理、免疫及生化改变等方面都与人类脱髓鞘疾病较为相似，因此应用最为广泛。

程序性死亡配体1(PD-L1)也称为分化簇274(CD274)是人类中由CD274 基因编码的蛋白质。通常，免疫系统对与外源或内源性危险信号相关的外来抗原起反应，这引发抗原特异性CD8+T细胞和/或CD4+辅助细胞的增殖。PD-L1与PD-1 结合传递抑制信号，其减少淋巴结中抗原特异性T细胞的增殖，同时减少调节性T细胞(抗炎，抑制性T细胞)中的细胞凋亡。

EAE是一种T细胞介导的炎性脱髓鞘疾病，与多发性硬化症具有许多临床和组织学特征，并且由髓鞘反应性CD4+Th1细胞诱导。有研究表明：PD-L1缺陷型 (PD-L1–/–)小鼠与野生型小鼠相比，PD-L1–/–小鼠的CD4+和CD8+T细胞反应显着增强，使用实验性自身免疫性脑脊髓炎髓鞘少突胶质细胞模型的研究表明，T细胞和宿主组织中的PD-L1限制了体内自身反应性CD4+T细胞的反应， PD-L1缺陷可将129S4/SvJae耐药菌株转化为实验性自身免疫性脑脊髓炎易感菌株；将致脑炎T细胞从野生型小鼠转移到PD-L1–/–受体导致疾病恶化。在易感C57BL/6背景下，PD-L1–/–小鼠的EAE也比野生型对照更严重。在EAE诱导期间向野生型C57BL/6小鼠施用PD-L1阻断mAb(10F.9G2)也会导致严重临床疾病的快速发作。PD-L1–/–小鼠对EAE的易感性增加证明了PD-L1在调节体内自反应CD4+T细胞反应中的重要作用。结果表明，PD-L1的T细胞，APC，和宿主组织中发挥着负向调节T细胞应答的关键作用。

为了研究该疾病的发病机理以及开发有效治疗方式，构建该疾病的小鼠模型对于该疾病的研究不可或缺，传统ES打靶基因敲除因嵌合体阳性率较低，并且需要与工具鼠交配才能获得删除Neo的杂合子，因此构建周期长达10-12个月。如何跨越“嵌合体”阶段并自删除Neo以减少两代繁育时间，才是真正快速的关键。

发明内容