[发明专利]靶向小鼠CD274基因的gRNA及构建EAE疾病小鼠模型的方法

权利要求书

1.一组靶向小鼠CD274基因的gRNA，其特征在于，包括四条gRNA，其核酸序列分别为：

gRNA1=SEQ ID NO 1=5’- GTATGGCAGCAACGTCACGATGG-3’；

gRNA2=SEQ ID NO 2=5’- TGCTGCATAATCAGCTACGGTGG-3’；

gRNA3=SEQ ID NO 3=5’- TGCTTGCGTTAGTGGTGTACTGG-3’；

gRNA4=SEQ ID NO 4=5’- GACGTCAAGCTGCAGGACGCAGG-3’。

2.一种小鼠CD274基因的基因敲除试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中包括如权利要求1中的一组靶向小鼠CD274基因的gRNA。

3.使用如权利要求1所述的一组靶向小鼠CD274基因的gRNA构建EAE疾病小鼠模型的方法，其特征在于，所述方法包括利用gRNA1、gRNA2、gRNA3、gRNA4将小鼠CD274基因敲除。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述gRNA1、gRNA2、gRNA3、gRNA4靶向切割小鼠CD274基因的第3个外显子的5＇端和3＇端的两侧。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述gRNA1、gRNA2、gRNA3将CD274基因第3个外显子之间的246bp的DNA切除，切除后的基因在转录形成的mRNA第2个外显子与第4个外显子剪切时融合，翻译蛋白质时形成移码突变。

6.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1）通过针对CD274基因设计、构建两对gRNA质粒，体外转录为RNA后，与Cas9 mRNA一起原核显微注射到受精卵中，取注射后存活的受精卵移植到假孕母鼠体内，产出小鼠，即为F0小鼠；提取F0代小鼠尾部DNA，PCR扩增并将产物送测序，获得测序鉴定阳性的F0代阳性小鼠；

2）F0代阳性小鼠与野生型小鼠进行交配，获得PCR鉴定阳性的F1代杂合子小鼠；

3）选择来自同一只F0代小鼠，基因型一致的F1代小鼠，达到性成熟后互配，获得F2代小鼠，对获得的F2代小鼠进行PCR及测序鉴定。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述步骤3中的测序引物为：

PCR测序引物=SEQ ID NO 5= 5’-ATTATCTAGCTTGCATCACCACCAC-3’。

8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述步骤3中PCR鉴定中的引物包括：

F1=SEQ ID NO 6=5'-ATTATCTAGCTTGCATCACCACCAC-3'；

R1=SEQ ID NO 7=5'-GAAGTGTGTGAACGAACGAATGAAC-3'。

9.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述步骤3中PCR鉴定中的

阳性扩增产物长度为437 bp，阴性扩增产物长度为679 bp。

10.如权利要求3-9任一项所述的方法构建获得的EAE疾病模型小鼠。