[发明专利]一种vGPCR蛋白靶向肽的筛选方法及其嵌合毒素与应用

说明书

本发明公开了一种vGPCR蛋白靶向肽的筛选方法，及其衍生而成的嵌合毒素与应用，涉及于生物医药技术领域领域，所述靶向肽筛选方法包括慢病毒包装及稳定细胞系构建；利用表达和不表达vGPCR蛋白的细胞系交替进行噬菌体筛选，His‑vGPCR及vGPCR1‑51‑Fc蛋白纯化和结合，vGPCR蛋白短肽的单克隆候选噬菌体的筛选。基于此靶向肽构建的嵌合毒素分子能够有效选择性杀伤KSHV相关肿瘤细胞，抑制肿瘤的进展，可被进一步开发为抗肿瘤药物，同时该靶向短肽也可被改造用作于以vGPCR为靶点的间接酶联免疫反应、免疫印迹和免疫组化等检测方法的试剂，用于基础研究和临床诊治的应用。

技术领域

本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及一种vGPCR蛋白靶向肽的筛选方法及其嵌合毒素与应用。

背景技术

卡波氏肉瘤病毒(Kaposi^,s sarcoma associated herpesvirus,KSHV)，又称人类疱疹病毒8型(HHV-8)，在全球范围内KSHV引发的肿瘤约占病原感染相关肿瘤总病例数的2％，其诱导的肿瘤类型包括卡波氏肉瘤(Kaposi’s Sarcoma,KS)、原发渗出性淋巴瘤(Primary Effusion Lymphoma,PEL)以及多中心性Castleman病(MulticentricCastleman’s disease,MCD)等，PEL目前尚无最佳治疗方案且预后很差，平均生存时间仅为6个月左右；KS是艾滋病患者在HIV滴度得到控制的情况下发生死亡的主要病因之一。

KSHV生命周期存在潜伏期和裂解复制期的两个感染阶段，由KSHV开放读码框ORF74编码的病毒G蛋白偶联受体(vGPCR)在裂解复制期高表达，对驱动KSHV诱变宿主细胞癌变过程及维持潜伏感染至关重要。因此，清除vGPCR表达的肿瘤细胞，对KSHV相关肿瘤的治疗至关重要。

裂解肽可通过在生物膜上寡聚，形成孔道，从而破坏细胞膜，杀死肿瘤细胞。相较于肿瘤治疗常规治疗药物，裂解肽的使用不存在耐药性问题。此外，肿瘤细胞表面负电性的磷脂酰丝氨酸水平略高于正常细胞，带正电性的裂解肽对于肿瘤细胞的杀伤活性高于正常细胞。同时，由于裂解肽含有D型氨基酸，能有效防止其被细胞内蛋白水解酶水解，从而延长作用效果；靶向结合短肽，其合成工艺成熟稳定，具有良好的肿瘤穿透能力，不易在体内诱发免疫应答，具有良好的应用前景，因此，研发vGPCR靶向肽对于KSHV相关的肿瘤的诊疗具有重要的应用价值。

发明内容

本发明提供了一种vGPCR蛋白靶向肽的筛选方法及其嵌合毒素与应用，所述靶向肽能够高效地识别结合vGPCR蛋白，基于此靶向肽构建的嵌合毒素分子能够有效选择性杀伤KSHV相关肿瘤细胞，抑制肿瘤的进展，可被进一步开发为抗肿瘤药物，同时该靶向短肽也可被改造用作于以vGPCR为靶点的间接酶联免疫反应、免疫印迹和免疫组化等检测方法的试剂，用于基础研究和临床诊治的应用。

为实现上述目的，本发明提供的技术方案是：

一种vGPCR蛋白靶向肽的筛选方法，其特征在于，所述靶向肽筛选方法包括利用表达和不表达靶蛋白的细胞多轮交替筛选，具体步骤包括：

步骤1、慢病毒包装及稳定细胞系构建；

步骤2、噬菌体库的筛选；

步骤3、His-vGPCR及vGPCR1-51-Fc蛋白纯化；

步骤4、结合vGPCR蛋白短肽的单克隆候选噬菌体的筛选。

优选的，步骤3采取四轮噬菌体淘选，淘选条件如下：

第1轮至第3轮淘选采用表达目标蛋白的vGPCR-GFP/HEK293T细胞系，第4轮采用不表达目标蛋白的GFP/HEK293T细胞系，5％BSA封闭时间依次是15min、30min、45min和60min，噬菌体原始库与封闭后的细胞悬液结合时间依次是60min、45min、30min和60min。