[发明专利]一种宏基因组样本去宿主化的试剂盒及其应用

说明书

本发明公开了一种宏基因组样本去宿主化的试剂盒及其应用。所述试剂盒包含细胞处理剂、消化缓冲液以及DNA消化酶，所述细胞处理剂包含胰酶以及毛地黄皂苷，所述胰酶的浓度为0.2～2g/mL，所述毛地黄皂苷的浓度为1～2.5％，百分比的单位为g/mL。本发明试剂盒可以有效降低人源背景并且富集病原微生物，提高病原微生物的检出率。

技术领域

本发明属于生物检测领域，具体涉及一种宏基因组样本去宿主化的试剂盒及其应用。

背景技术

感染性疾病造成的死亡率在逐年上升，而对症下药和及时用药是有效提高患者生存率的重要途径。对症下药需对病原体进行精准诊断，传统的病原学诊断方法包括培养、形态学检查、抗原抗体检测、PCR、质谱等，但阳性率低、通量低，且不能对新发病原体进行有效鉴定。随着二代测序技术的发展，基于宏基因组学的二代测序技术(mNGS)的病原微生物检测在临床应用范围越来越广，在传统病原体诊断、未知新发病原体鉴别、复合感染诊断等方面具有良好的应用前景，为感染性疾病的防控提供了重要手段，也促进了临床诊断能力的提升。

mNGS应用检测样本类型广泛，包括血液、脑脊液、痰液、肺泡灌洗液、局灶样本、胸腹水以及其它体液样本类型。但是样本中存在大量的宿主细胞或者宿主游离核酸，而微生物含量极少。采用传统的核酸抽提方法进行核酸提取后建库和宏基因组测序，测序得到的reads大部分是宿主序列，一般可以达到90％以上，而微生物序列占比很小。人源占比较高不仅造成数据量的浪费，检测成本高，也会降低微生物检出的灵敏度，所以宏基因组检测样本的去宿主一直是市场急需产品。

现有的去宿主的方法包括：(1)离心法：基于人源细胞与微生物细胞大小或沉降系数的差异，采用离心法或者过滤以及流式细胞仪将人源细胞分离出去。(2)差异裂解法：基于人源细胞膜与病原微生物细胞裂解难易程度差异，核酸提取前，选择性裂解人源细胞后，消化宿主核酸，从而富集病原微生物。(3)甲基化法：人源DNA甲基化程度较高，而大多数微生物基因组缺乏甲基化DNA。利用捕获的方式去除核酸提取后甲基化修饰位点从而去除人源核酸。(4)杂交捕获法：核酸提取后，采用宿主核酸探针杂交去除部分人源核酸。现有的以上方法存在诸多缺陷，具体地：(1)离心法：虽然该方法简单，但是可能损失细胞内的胞内菌、寄生虫等病原体，并且去宿主效率不高；(2)差异裂解法：由于裂解buffer组分以及浓度差异，人源细胞裂解程度会有所不同，且裂解程度过大，会造成个别细胞结构脆弱的病原体裂解，比如支原体、病毒等，从而造成病原体检出漏检；(3)甲基化：在真菌以及寄生虫等真和病原体同样存在甲基化位点，所以甲基化去宿主可能会造成真菌以及寄生虫的漏检；(4)杂交捕获法：需要依赖于捕获探针的设计以及捕获效率，成本较高，而且捕获时间长，不利于规模化应用。

因此，亟需一种能够有效去除宿主核酸并且富集微生物，从而提高病原体检出敏感性，有效辅助临床进行感染检测的去宿主化并富集微生物的方法及试剂盒。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是为克服现有技术中缺乏能够高效去除宿主核酸并且富集微生物的缺陷，提供一种宏基因组样本去宿主化的试剂盒及其应用。

本发明主要通过以下技术方案解决上述技术问题。

本发明提供一种用于宏基因组样本去宿主化的试剂盒，其包含细胞处理剂、消化缓冲液以及DNA消化酶，所述细胞处理剂包含胰酶以及毛地黄皂苷，所述胰酶的浓度为0.2～2g/mL，所述毛地黄皂苷的浓度为1～2.5％，百分比的单位为g/mL。

在本发明一优选实施方案中，所述胰酶的浓度为1g/mL。

在本发明另一优选实施方案中，所述毛地黄皂苷的浓度为2％。