[发明专利]一种应用于结核分枝杆菌的单碱基基因编辑系统及方法

说明书

本发明公开了一种应用于结核分枝杆菌的单碱基基因编辑系统及方法，利用CRISPR技术与胞嘧啶核苷脱氨酶系统偶联，实现了对结核分枝杆菌基因的高效的遗传操作。本发明的单碱基基因编辑系统通过抑制RecA介导的同源重组和NucS介导的错配修复来提升碱基编辑的效率，能够实现G:C到A:T的单个碱基替换以及使目标基因翻译提前终止，为研究结核分枝杆菌提供了有效的技术手段。

技术领域

本发明涉及基因编辑系统，特别涉及一种基于CRISPR/Cas系统的胞嘧啶核苷脱氨技术对结核分枝杆菌进行单碱基基因编辑的系统和方法。

背景技术

结核分枝杆菌(mycobacterium tuberculosis)是结核病(TB)的病原体，是单一病原体导致死亡的主要原因。世界卫生组织(WHO)估计，2019年，全球有1000万例新发结核病患者。耐多药结核(Multidrug-resistant TB,MDR-TB)和广泛耐药结核(Extensivelydrug-resistant TB,XDR-TB)菌株的出现是一个持续存在的健康问题，迫切需要新的治疗策略。药物靶标的识别和表征强烈依赖于有效的基因操作技术。然而，分枝杆菌的遗传操作极具挑战性——主要是因为它们缓慢的生长速度、致病性，以及高GC含量的基因组。因此，当前急需一种高效且实用的方法对结核分枝杆菌进行基因编辑，了解其相关耐药机制，并对临床治疗做出指导。

近年来，分枝杆菌基因编辑技术快速发展，特别是得益于CRISPR-Cas系统的出现。一种基于同源重组(homologous recombination,HR)和CRISPR-Cas12a介导的基因编辑系统可以在耻垢分枝杆菌中快速产生点突变、缺失和插入。此外，一种CRISPR-Cas介导的非同源末端连接(non-homologous end joining,NHEJ)基因组编辑工具，允许在耻垢分枝杆菌和结核分枝杆菌基因组上产生无标记的碱基缺失。然而，这两种方法都不能在结核分枝杆菌中用于引入点突变或进行精确的基因操作。

单碱基编辑器的发现为精确的基因操作提供了一种新的策略。该方法不同于HR和NHEJ需要引入DNA双链断裂(double-strand breaks,DSBs)或供体DNA模板。目前的碱基编辑器主要包含催化活性受损的Cas核酸酶和单链DNA脱氨酶——胞嘧啶核苷脱氨酶(如APOBEC)或腺嘌呤核苷脱氨酶(TadA)。胞嘧啶核苷脱氨酶特异性催化胞嘧啶(C)转化为尿嘧啶(U)，尿嘧啶被DNA聚合酶读取为胸腺嘧啶(T)；腺嘌呤核苷脱氨酶将腺嘌呤(A)转化为肌苷(I)，后者被读作鸟嘌呤(G)。在胞嘧啶碱基编辑器(cytosine base editors，CBEs)中，将APOBEC与催化活性受损的Cas9蛋白相融合，在具有靶向作用的sgRNA引导下到达目标基因位置时，可以形成由蛋白质-RNA-DNA构成的“R-loop”结构，暴露的单链DNA窗口可作为APOBEC发挥作用的底物，窗口内任何胞嘧啶核苷均可发生脱氨基作用，并形成U:G中间体。在细菌细胞中，DNA形成U:G中间体时，通常由尿嘧啶N-糖基化酶(uracil DNAglycosylase，UNG)发挥碱基切除修复(base excision repair,BER)作用来切除碱基U，为了保护编辑后的U:G中间体免于被UNG切除，可以将尿嘧啶DNA糖基化酶抑制子(uracil DNAglycosylase inhibitor,UGI)直接与催化活性受损的Cas9的C末端融合在一起，其可以抑制UNG发挥碱基切除修复，并促进细胞发生错配修复形成U:A中间体，进而在DNA复制时识别为T:A，从而实现了目标位点碱基C到T的转换。此外，通过催化特殊密码子(CAA、CAG、CGA或TGG)的转换，可以通过产生一个提前终止的密码子来破坏目的基因，从而失活基因功能。为了提高碱基编辑效率，大多数碱基编辑器将无核酸酶活性的Cas9(dead Cas9，dCas9)替换为Cas9 nickase(nCas9)。

胞嘧啶碱基编辑系统已经在大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、链霉菌等微生物中发展和应用，但在分枝杆菌中还没有开发。如果能够实现对结核分枝杆菌单碱基基因编辑，该技术将与CRISPR-HR和CRISPR-NHEJ相互补充，共同实现结核分枝杆菌基因组各种遗传操作。