[发明专利]一种应用于结核分枝杆菌的单碱基基因编辑系统及方法

权利要求书

1.一种应用于结核分枝杆菌的单碱基基因编辑系统，是一种双质粒的CRISPR-Cas辅助的胞嘧啶核苷脱氨编辑系统，包括单碱基编辑器质粒和抑制DNA修复元件质粒，其中，所述单碱基编辑器质粒包含sgRNA作用元件和编码nCas9_sth、胞嘧啶核苷脱氨酶及尿嘧啶DNA糖基化酶抑制子形成的融合蛋白的基因，所述抑制DNA修复元件质粒包含降低RecA依赖的同源重组的编码RecX的基因元件和降低NucS依赖的错配修复的编码NucS_E107A的基因元件。

2.如权利要求1所述的单碱基基因编辑系统，其特征在于，所述单碱基编辑器质粒是复制性穿梭载体，含有分枝杆菌复制起点oriM和大肠杆菌复制起点oriE。

3.如权利要求2所述的单碱基基因编辑系统，其特征在于，所述单碱基编辑器质粒还含有sacB反向筛选标记。

4.如权利要求1所述的单碱基基因编辑系统，其特征在于，所述单碱基编辑器质粒上编码nCas9_sth的基因为来源于嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)的cas9_sth1基因，其蛋白质序列的第九位天冬氨酸突变为丙氨酸。

5.如权利要求1所述的单碱基基因编辑系统，其特征在于，所述单碱基编辑器质粒上编码胞嘧啶核苷脱氨酶的基因是APOBEC1基因，其优化序列如SEQ ID No:9所示；编码尿嘧啶DNA糖基化酶抑制子的基因是UGI基因，其优化序列如SEQ ID No:10所示。

6.如权利要求5所述的单碱基基因编辑系统，其特征在于，所述单碱基编辑器质粒上编码的融合蛋白中，APOBEC1通过如SEQ ID No：16所示的16个氨基酸的连接子连接到nCas9_sth的N端；UGI通过如SEQ ID No：17所示的4个氨基酸的连接子连接到nCas9_sth的C端。

7.如权利要求1所述的单碱基基因编辑系统，其特征在于，所述单碱基编辑器质粒上的融合蛋白的基因由诱导型启动子驱动表达；所述抑制DNA修复元件质粒上的编码RecX的基因和编码NucS_E107A的基因由诱导型启动子驱动表达。

8.如权利要求1所述的单碱基基因编辑系统，其特征在于，所述NucS_E107A为NucS蛋白序列第107位谷氨酸突变为丙氨酸的突变体。

9.一种对结核分枝杆菌进行单碱基基因编辑的方法，利用权利要求1～8任一所述的单碱基基因编辑系统进行如下操作：

1)用所述抑制DNA修复元件质粒转化结核分枝杆菌，并将转化子制备成感受态细胞；

2)将靶向目标基因片段的sgRNA序列连接到所述单碱基编辑器质粒上的sgRNA作用元件中，得到含有sgRNA序列的单碱基编辑器质粒；

3)用步骤2)制备的含有sgRNA序列的单碱基编辑器质粒转化步骤1)制备的感受态细胞，诱导相关元件表达进行基因编辑，对得到的转化子进行验证，得到目标基因片段被编辑的转化子。

10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述sgRNA序列长度为20bp，编辑目标位点位于目标基因片段中PAM序列远端第2-16位。