[发明专利]一种携带有猪GMCSF分子佐剂的猪支原体肺炎基因工程亚单位疫苗制备方法及其应用

说明书

本发明公开的是一种携带有猪GMCSF分子佐剂的猪支原体肺炎基因工程亚单位疫苗制备方法及其应用，采用杆状病毒表达系统表达猪肺炎支原体P97R1、P46和P42嵌合抗原蛋白(P97R1P46P42)，以及融合了分子佐剂GMCSF的重组抗原蛋白(P97R1P46P42‑GMCSF)，其中融合了分子佐剂的重组蛋白可以诱导产生更高的的体液免疫和细胞免疫水平，所以，GMCSF可以作为猪肺炎支原体相关疫苗产品的佐剂或免疫增强剂，有望为养猪业提供安全有效且操作简便的疫苗产品。

技术领域

本发明涉及一种疫苗制备方法及其应用，更具体一点，涉及一种携带有猪GMCSF分子佐剂的猪支原体肺炎基因工程亚单位疫苗制备方法及其应用，属于基因工程领域。

背景技术

猪支原体肺炎(Mycoplasmal pneumoniae of swine,MPS)是由于感染猪肺炎支原体(Mycoplasma hyopneumonia,Mhp)而引发的慢性呼吸道传染病，又称“猪气喘病”或“猪地方性肺炎(porcine enzootic pneumonia,PEP)”，仔猪感染偏多。临床上以哮喘、阵发性痉挛性咳嗽、食欲减退和肺部水肿为主要特征，最终导致窒息死亡。该病具有感染率高、传染性高的特点，猪肺炎支原体常会与多杀性巴氏杆菌(Pasteurella multocida)、猪繁殖呼吸综合症病毒(Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus,PRRSV)和猪圆环病毒(Porcine circovirus,PCV)等病原体协同感染，增加了相关疾病的严重性和潜在的持久性，使呼吸道疾病加重，继而引起呼吸系统疾病综合症(Porcine Respiratory DiseaseComplex,PRDC)，最终导致死亡率上升，给世界养猪业带来巨大的经济损失。

大量的研究表明，在猪肺炎支原体感染过程中，细胞膜上黏附因子抗原引发的免疫效应起关键性的作用。Mhp与猪呼吸道上皮细胞纤毛的特异性黏附是引起猪支原体肺炎的关键，而此黏附过程中是多种黏附因子共同作用的结果，现已发现的P97、P46和P42是三种起主要黏附功能的膜蛋白。

分子佐剂是一类可以调节细胞间相互作用，能够刺激免疫系统针对特定抗原产生更强保护效应的蛋白质或其他小分子化合物，其中包括细胞因子，共刺激分子，趋化因子，补体，凋亡分子和泛素以及其他正在研究的基因佐剂等。其中粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(Granulocyte-macrophage Colony Stimulating Factor，GMCSF)对造血系统有广泛的作用，能刺激粒细胞和巨噬细胞的增殖、分化及活化，增加造血功能；也可以增强中性粒细胞、嗜酸性粒细胞及单核粒细胞的多种功能，增强免疫细胞吞噬细菌及杀灭癌细胞等免疫活力，是一种具有良好应用价值的分子佐剂。

发明内容

为了解决上述现有技术问题，同时提高重组抗原蛋白或者含有重组抗原蛋白的细胞悬液所诱导产生的免疫应答水平，本发明提供了一种猪肺炎支原体相关疫苗产品的免疫增强剂，有望为养猪业提供安全有效的疫苗等产品。本发明的技术特点是一种携带有猪GMCSF分子佐剂的猪支原体肺炎基因工程亚单位疫苗制备方法及其应用。

为了达到上述目的，本发明是通过以下技术方案实现：

本发明提供了一种携带有猪GMCSF分子佐剂的猪支原体肺炎基因工程亚单位疫苗制备方法，其特征在于其制备方法包括如下步骤：

步骤1)：获取目的基因的以及重组载体的构建；

步骤2)：重组杆状病毒基因组的制备；

步骤3)：应用杆状病毒表达系统表达目的蛋白；

步骤4)：目的蛋白的鉴定和纯化。

优选的，所述目的基因的获取以及重组载体的构建包括如下步骤：