[发明专利]一种携带有猪GMCSF分子佐剂的猪支原体肺炎基因工程亚单位疫苗制备方法及其应用

权利要求书

1.一种携带有猪GMCSF分子佐剂的猪支原体肺炎基因工程亚单位疫苗制备方法，其特征在于其制备方法包括如下步骤：

步骤1)：获取目的基因的以及重组载体的构建；

步骤2)：重组杆状病毒基因组的制备；

步骤3)：应用杆状病毒表达系统表达目的蛋白；

步骤4)：目的蛋白的鉴定和纯化。

2.根据权利要求1所述的一种携带有猪GMCSF分子佐剂的猪支原体肺炎基因工程亚单位疫苗制备方法，其特征在于：

所述目的基因的获取以及重组载体的构建包括如下步骤：

(1.1)获取猪GMCSF基因序列，对猪GMCSF基因序列的外显子序列进行密码子优化，并同时在其N端添加GGPGS蛋白接头并对其进行化学合成，化学合成后的目的基因连接在pUC57载体的EcoR V酶切位点之间，表达重组蛋白P97R1P46P42的质粒pFastBac Dual-P97R1P46P42保存在-80℃冰箱中；

(1.2)结合pFastBac Dual杆状病毒表达载体polyhedrin promoter下游的多克隆位点，利用PCR方法在GMCSF基因序列的前后两端引入Xba I和Hind III酶切位点，目的基因和载体经过双酶切后连接到载体pFastBac Dual-P97R1P46P42的Xba I和Hind III酶切位点之间，然后转化到E.coli TG1感受态细胞中，将鉴定成功后的重组载体命名为pFastBacDual-P97R1P46P42-GMCSF。

3.根据权利要求1所述的一种携带有猪GMCSF分子佐剂的猪支原体肺炎基因工程亚单位疫苗制备方法，其特征在于：

所述重组杆状病毒基因组的制备包括如下步骤：

(2.1)将重组质粒pFastBac Dual-P97R1P46P42和pFastBac Dual-P97R1P46P42-GMCSF转化到E.coli DH10Bac感受态细胞中，经过蓝白斑筛选之后挑取重组DH10Bac菌斑，并进行杆状病毒基因组(Bacmid)的提取以及鉴定。

4.根据权利要求1所述的一种携带有猪GMCSF分子佐剂的猪支原体肺炎基因工程亚单位疫苗制备方法，其特征在于：

所述应用杆状病毒表达系统表达目的蛋白包括如下步骤：

(3.1)取生长良好的Sf9细胞4×10⁶个，重悬于12mL Sf900培养基中，按照每孔2mL用量铺六孔板，混匀后28℃静置生长过夜；

(3.2)按照FuG6Transfection Reagent的使用说明将重组Bacmid转染到Sf9细胞中，于28℃静置培养3天，在第3天时观察细胞的发病状态并收集上清液作为P1代重组杆状病毒；

(3.3)将P1代重组杆状病毒按照0.5％的比例转接到细胞密度为4×10⁶个/mL的生长良好的Sf9细胞中，培养72h后离心收集上清液得到P2代重组杆状病毒，然后再按照相同比例重复一次扩增得到P3代重组杆状病毒；

(3.4)将P3代重组杆状病按照5％比例接种到20mL细胞密度为2×10⁶个/mL的生长良好的Sf9细胞中，培养72h，离心收集细胞沉淀，用PBS重悬细胞至终体积为5mL，然后于冰上超声破碎，结束后按1mL/份分装并立即冻存于-80℃冰箱中。

5.根据权利要求4所述的一种携带有猪GMCSF分子佐剂的猪支原体肺炎基因工程亚单位疫苗制备方法，其特征在于：

步骤(3.4)中对表达的重组蛋白采用Western Blot鉴定，其鉴定包括如下步骤：

(4.1)取步骤(3.4)中冻存的细胞悬液160μL，然后加入40μL 5×Loading Buffer，加热煮沸10min后做12％SDS-PAGE；

(4.2)分别用重组蛋白rP97和rP42的兔多克隆抗体通过Western Blot方法来检测两种重组蛋白P97R1P46P42和P97R1P46P42-GMCSF。