[发明专利]一种利用液相色谱串联质谱技术检测血浆中激素的方法

说明书

本发明公开了一种利用液相色谱串联质谱技术检测血浆中激素的方法，涉及血浆中激素检测技术领域。本发明包括以下步骤：步骤一：样品前处理：向待测标本加入内标，混匀后加入甲醇，振荡混匀，再加入去离子水，再次振荡混匀后离心，取上清液置于96孔板萃取装置中，依次用淋洗液乙腈/水、正己烷淋洗，再用洗脱液乙腈/甲醇、水依次洗脱；步骤二：根据激素类化合物化学和物理特性，采用超高效液相色谱串联四级杆质谱仪进行检测；步骤三：定性判断和定量分析。本发明通过选择蛋白沉淀与固相萃取法结合，简单快捷的同时萃取富集出多种激素，极大程度的排除了大分子蛋白质、小分子蛋白、多肽、以及一些小分子物质的干扰。

技术领域

本发明涉及血浆中激素检测技术领域，特别是涉及一种利用液相色谱串联质谱技术检测血浆中激素的方法。

背景技术

目前测定激素的方法主要有生物法和化学法，生物法包括酶联免疫吸附(ELISA)、放射免疫测定(RIA)、免疫化学发光分析(ICMA)等，化学法包括气相色谱-质谱法(GC-MS、GC-MS/MS)[和液相色谱-质谱法(LC-MS/MS)]；

生物法在过去被认为是测定生物样品中激素的理想方法，但是现在的研究发现生物法存在一定的缺陷，首先，激素类代谢物在结构上具有高度的相似性，因此，使用免疫测定法很难控制或排除生物基质中可能存在的结构相似物的干扰，其次，免疫检测方法是建立在抗体对抗原分子识别的基础上，而人体内激素结构相似，免疫检测技术的特异性抗体的交叉反应的专一性差，易出现假阳性结果，第三，并不是所有的目标激素代谢物都存在相应的抗血清以得到准确的免疫测定，这一点对于激素结合物的免疫测定尤为明显，最后，免疫检测一次只能分析一种被测物，因此测定一种激素的多种代谢物就需要多次测定。

近年来，质谱技术已发展成为分析内源性代谢物和药物的高通量定量方法，通过与气相色谱(GC)或高效液相色谱(HPLC)联用，可以快速准确地分离多种化合物，并且能在一定程度上完成自动化分析，色谱-质谱联用检测技术是当前的发展趋势，也是目前最为可靠的激素检测方法，同时可验证其他测定方法的准确性，并鉴定未知物质的结构等，气相色谱-质谱技术检测，要求被测组分具有挥发性、低沸点等，因此在检测前需要对样品进行衍生化，以提高激素的挥发性和热稳定性，该方法的缺点是样品处理过程繁琐，色谱分析时间较长；

LC-MS/MS用于内源性激素检测通常不需要繁琐的衍生化步骤，避免了衍生化步骤中副反应或反应不完全造成的损失，同时大大减少了样品和试剂的损耗、缩短了前处理的时间，与HPLC相比，超高效液相色谱(UPLC)，运用亚二微米的小粒径填料可以增加分离度、灵敏度，同时可以得到更短的分离时间，因此，超高效液相色谱串联质谱技术(UPLC-MS/MS)在多种激素同时检测中具有较强的优势；基于此，我们提出一种利用液相色谱串联质谱技术检测血浆中激素的方法。

发明内容

本发明的目的在于提供一种利用液相色谱串联质谱技术检测血浆中激素的方法，有效去除大部分的干扰物质，可以同时检测和快速提取多种激素，以解决上述背景中提出的问题。

为解决上述技术问题，本发明是通过以下技术方案实现的：

本发明为一种利用液相色谱串联质谱技术检测血浆中激素的方法，包括以下步骤：

步骤一：样品前处理：

向待测标本加入内标，混匀后加入甲醇，振荡混匀，再加入去离子水，再次振荡混匀后离心，取上清液置于96孔板萃取装置中，依次用淋洗液乙腈/水、正己烷淋洗，再用洗脱液乙腈/甲醇、水依次洗脱；

步骤二：根据激素类化合物化学和物理特性，采用超高效液相色谱串联四级杆质谱仪进行检测；

步骤三：定性判断和定量分析：

根据目标激素与其内标物的相对保留时间、定量离子对的丰度比、目标激素的定性离子与定量离子的丰度比，来判断激素是否存在于血浆样品中。