[发明专利]一种特定HBV序列插入到特定基因区域的细胞模型及其构建方法与应用

说明书

本发明公开一种特定HBV序列插入到特定基因区域的细胞模型及其构建方法与应用，该方法步骤如下：利用CRISPR/Cas9方法定点敲入HBV的P序列使其整合到HEPG2细胞的Chr5:1295920位置200bp区域，实现所述Chr5:1295920位置发生切割，形成DNA双链断裂；同时将含有Chr5:1295920目标位点上下游同源臂的DNA片段P载体导入所述HEPG2细胞中，实现HBV的P序列定点整合到HEPG2细胞的Chr5:1295920位置200bp范围内。本发明首先确定了病毒整合热点区域上的位点，进而进行了特定序列的病毒整合，建立了一株具有特殊性质及基因组特征的病毒整合细胞株，其可以广泛应用在肝癌与HBV病毒关系研究，抗病毒药物筛选，病毒整合研究等领域。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体地说是涉及一种细胞模型，更为具体地说是涉及一种特定HBV序列插入到特定基因区域的细胞模型，以及该细胞模型的构建方法与应用。

背景技术

病毒整合与多种肿瘤发生关系密切，其中HPV病毒整合与宫颈癌的发生，HBV病毒整合与肝癌的发生具有直接关系。近年来随着高通量测序技术的普及，病毒整合规律特征逐渐显现，多项研究发现了病毒整合在人类基因组上具有热点区域，然而这些热点区域的病毒整合所造成的影响，功能并不明确。目前，亟需开发一种细胞模型(病毒整合)来对病毒整合功能开展研究。现今随机病毒整合的细胞虽已有较多模型，然而在关键基因组位置整合插入特定片段的细胞模型还有待于开发。

发明内容

基于上述技术问题，本发明提出一种特定HBV序列插入到特定基因区域的细胞模型及其构建方法与应用。

本发明所采用的技术解决方案是：

一种特定HBV序列插入到特定基因区域的细胞模型，该细胞模型是采用HBV基因组特定的P序列，定点整合到HEPG2细胞系或多类肝细胞系得到。

进一步的，所述定点整合是通过采用HBV基因组特定的P序列插入到HEPG2细胞的Chr5:1295920前后200bp范围内的位置。

进一步的，所述定点整合为利用CRISPR/Cas9方法定点敲入。

进一步的，所述HBV基因组特定的P序列为序列表中序列1的第652-3263位所示的P序列。

一种特定HBV序列插入到特定基因区域的细胞模型的构建方法，步骤如下：

利用CRISPR/Cas9方法定点敲入HBV的P序列使其整合到HEPG2细胞的Chr5:1295920位置200bp区域内，实现所述Chr5:1295920位置发生切割，形成DNA双链断裂；

同时将含有Chr5:1295920目标位点上下游同源臂的DNA片段P载体导入所述HEPG2细胞中，实现HBV的P序列定点整合到HEPG2细胞的Chr5:1295920位置200bp区域内。

进一步的，将表达所述靶向目标位置Chr5:1295920区域的gRNA与Cas9二合一质粒载体和含有Chr5:1295920目标位点上下游同源臂的HBV基因组特定P序列DNA载体，记为DNA片段P，导入所述HEPG2细胞中；

所述gRNA的靶序列具体为序列2，所述含有Chr5:1295920目标位点上下游同源臂的HBV基因组特定P序列DNA载体具体为序列1；所述靶向目标位置Chr5:1295920区域的gRNA与Cas9二合一质粒载体中还含有puro抗性基因。

进一步的，所述gRNA与Cas9的二合一质粒载为向gRNA克隆载体中通过同源重组连接的方法整合入序列3所示的DNA片段得到的重组载体。